減毒沙門菌介導(dǎo)的基于甲病毒復(fù)制子載體的自殺基因系統(tǒng)的抗腫瘤效應(yīng)研究.pdf

1、自殺基因治療系統(tǒng)如HSV-TK/GCV和CD/5-Fc系統(tǒng)是腫瘤基因治療的手段之一,新發(fā)現(xiàn)的一種自殺基因系統(tǒng)-大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶(ePNP)/2-氟-2-脫氧腺苷(F-dAdo)系統(tǒng)已被證實(shí)對(duì)腫瘤具有強(qiáng)大的殺傷效應(yīng)。但是,仍然存在一些問(wèn)題有待解決:1.如何大量表達(dá)自殺基因,從而最大限度地提高前藥的轉(zhuǎn)化和利用效率。2.是否能夠激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生明顯的抗腫瘤效應(yīng)。3.如何增加腫瘤治療的靶向性。有研究顯示,在表達(dá)載體中引入甲病毒復(fù)制子

2、序列,能將外源抗原的表達(dá)效率提高數(shù)倍。減毒鼠傷寒沙門氏菌已經(jīng)被確認(rèn)能夠選擇性的在腫瘤組織里集聚,且能夠順利的將攜帶的真核表達(dá)質(zhì)粒運(yùn)輸?shù)侥[瘤細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。結(jié)核桿菌熱休克蛋白65能夠通過(guò)其多肽結(jié)合閾與抗原結(jié)合形成抗原-肽復(fù)合物,進(jìn)而被抗原呈遞細(xì)胞以MHC-I分子的途徑呈遞,激活針對(duì)腫瘤的特異性的CTL細(xì)胞。
　　本論文的第一部分,我們以質(zhì)粒pSFV1為基礎(chǔ),首先構(gòu)建了人巨細(xì)胞病毒(CMV)通用啟動(dòng)子調(diào)控下的DNA表達(dá)載體PSC-eP

3、NP-mHsp65,然后將該載體導(dǎo)入到減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207中,設(shè)計(jì)出自殺基因治療系統(tǒng)SL/PSC-ePNP-mHsp65。通過(guò)體外感染腫瘤細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)能夠高效率的表達(dá)外源基因,加入前藥F-dAdo后利用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和高效液相色譜法證實(shí)該系統(tǒng)在體外能夠產(chǎn)生強(qiáng)大的殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示口服該重組細(xì)菌疫苗后,SL7207能優(yōu)先在腫瘤組織中集聚,配合前藥F-Ado能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)大的殺傷作用,同時(shí)還能夠引起強(qiáng)烈

4、的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng),顯著抑制腫瘤生長(zhǎng),甚至部分實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤的清除。
　　為了進(jìn)一步提高上面重組細(xì)菌疫苗的靶向性,我們?cè)谡撐牡牡诙糠种?構(gòu)建了人端粒酶啟動(dòng)子(hTERT)調(diào)控下的DNA表達(dá)載體pShT-ePNP,利用SL7207能夠在腫瘤組織中積聚的特性,雙重靶向性地將構(gòu)建好的質(zhì)粒運(yùn)輸?shù)侥[瘤細(xì)胞中表達(dá),體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該系統(tǒng)能在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平高效率表達(dá)ePNP基因,加入前藥F-Ado后引起細(xì)胞的廣泛壞死,且呈良好的劑量和時(shí)間依賴