選擇復(fù)制性腺病毒載體攜帶自殺基因Dm-dNK（果蠅脫氧核糖核苷酸激酶）的抗腫瘤研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌是威脅女性健康的主要惡性腫瘤之一。根據(jù)最新的全球腫瘤統(tǒng)計報告，乳腺癌在女性中發(fā)病率最高，且為女性癌癥死亡的主因。在中國，其發(fā)病率也呈逐年上升趨勢且更加年輕。以手術(shù)、放療、化療和內(nèi)分泌治療為主的綜合治療模式可以使患者獲得較高的生存率，但仍有很高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率。另外，對于復(fù)發(fā)性和晚期乳腺癌患者，目前為止也沒有好的治療方法。因此，探索治療乳腺癌的新方法具有重要的臨床價值，隨著分子生物學(xué)基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，分子治療逐

2、漸開始應(yīng)用于臨床疾病的研究，其中的分子化療即自殺基因療法顯示出良好的應(yīng)用前景。
　　溶瘤病毒(oncolytic virus)是近年來發(fā)展非常迅速的一種腫瘤治療策略，并已取得一些令人鼓舞的研究成果。溶瘤病毒能靶向性感染腫瘤細胞并在細胞內(nèi)復(fù)制，殺死腫瘤細胞。目前，國內(nèi)外正在研究開發(fā)的溶瘤病毒有十多種。而其中增殖型腺病毒又稱選擇復(fù)制型腺病毒(conditionally replicating adenovirus，CRAd)，由于可利

3、用腫瘤與正常組織細胞間結(jié)構(gòu)及代謝途徑的差異，靶向性地在腫瘤細胞內(nèi)復(fù)制增殖，最終裂解腫瘤細胞，而成為研究熱點之一。
　　pZD55載體（即在腺病毒E1b區(qū)除去55KD基因），是一種新型選擇復(fù)制型腺病毒載體。pZD55與經(jīng)典的ONYX-015基本相似，它們能專門進入p53功能缺失的腫瘤，并將后者殺死。但前者構(gòu)建的方法與ONYX-015完全不同，前者是Ad5;后者為Ad2/Ad5融合病毒。尤其重要的是pZD55含有克隆位點可以插入外源抗

4、癌基因而成為pZD55-gene，即構(gòu)成靶向基因-病毒治療，而ONYX-015則不可能。
　　我們在果蠅多底物脫氧核糖核苷酸激酶氨基酸序列中最后10位予以隨機突變，突變后的氨基酸分別為第244位谷氨酸、245位絲氨酸、251位絲氨酸、252位蘇氨酸，形成一個突變型果蠅多底物脫氧核苷酸激酶(Dm-dNKmu)。利用選擇復(fù)制型腺病毒載體將Dm-dNK基因或者Dm-dNKmu基因?qū)肴橄侔┘毎礛CF-7，MBA-MD-231和Bcap

5、-37，加入不同濃度的不同核苷類藥物做MTT實驗，分析Dm-dNK對癌細胞的殺傷作用及不同癌細胞系對Dm-dNK的敏感性后，進而做荷瘤動物實驗，探討Dm-dNK/核苷類似物對乳腺癌細胞體內(nèi)外的影響，建立一種新的自殺基因治療方式，為有效干預(yù)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展提供有力的實驗基礎(chǔ)。
　　方法：
　　一、細胞培養(yǎng)
　　乳腺癌腫瘤細胞系MCF-7，MDA-MB-231和Bcap-37購買于上海細胞庫，正常細胞購買于ATCC.細胞使

6、用L-15培養(yǎng)基或高糖DMEM培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有10％的血清，雙抗。培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5％CO2.
　　二、腺病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
　　根據(jù)Dm-dNK和Dm-dNKmu的cDNA，在其兩端設(shè)計出帶EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位點的引物，利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)將Dm-dNK/Dm-dNKmu克隆到質(zhì)粒載體pENTER12中，質(zhì)粒pENTER12包含有CMV啟動子，多克隆位點和SV40 polyA尾，pENTER12-dN

7、K與質(zhì)粒PPE3-RC利用內(nèi)切酶LR重組，并與質(zhì)粒pZD55共轉(zhuǎn)染至腺轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞HEK293細胞，9-14天后出現(xiàn)病毒空斑，利用DNA提取試劑盒抽提重組后病毒的DNA，通過PCR驗證后命名為ZD55-dNK/ZD55-dNKmu。復(fù)制缺陷5型腺病毒Ad-GFP用于比較不同細胞系間感染率的區(qū)別。
　　三、酶活性測定
　　通過提取細胞的蛋白，用放射性[3H]標記作為底物的核苷酸藥物，混合液在Whatman DE-81濾紙上

8、反應(yīng)不同時間后經(jīng)液閃測量儀測定放射活性。
　　四、Dm-dNK基因的表達
　　用TRIZOL方法提取純化ZD55-CMV-DNK病毒感染后的人乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7;人胚肺成纖維上皮細胞株MRC-5、WI38，使用反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒對目的基因的表達進行檢測。
　　五、CPE實驗檢測細胞殺傷
　　取對數(shù)生長期的腫瘤細胞及正常細胞，接種于24孔培養(yǎng)板中，24h細胞貼壁后，吸去上清，按MOI=0，

9、0.1，1，10，100加入病毒，設(shè)實驗組及對照組。37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)4h后洗去病毒液，每孔加1ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。48h后于倒置顯微鏡下觀察、拍照
　　六、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡
　　對數(shù)生長期的細胞計數(shù)鋪板，按合適密度鋪板，分別感染病毒，同時設(shè)立陰性對照，37℃，5％CO2孵箱培養(yǎng)4h后洗去病毒液，每組加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。感染后24h加入前藥或PBS感染后48h結(jié)束實驗。根據(jù)AnnexinⅤ-FITC/PI試劑使

10、用說明調(diào)整細胞為106個/ml，離心棄上清，加入10μlAnnexinⅤ-FITC和5μl PI，輕搖勻，室溫避光反應(yīng)15min，1h內(nèi)流式細胞儀檢測，各組細胞用流式細胞計量儀分別進行檢測。
　　結(jié)果：
　　一、選擇復(fù)制型腺病毒載體質(zhì)粒ZD55-CMV-dNK構(gòu)建及轉(zhuǎn)染:
　　通過基因操作方法將腫瘤治療基因Dm-dNK，順向插入到pENTR-12的多克隆位點，構(gòu)建成PENTR12-Dm-dNK質(zhì)粒。該質(zhì)粒與PPE3-c

11、cdB重組，用Lipofectamine2000將PPE3-CMV-DNKmu質(zhì)粒與SG502共轉(zhuǎn)染至293細胞，應(yīng)用PCR進行鑒定。電泳證實CMV啟動子長度為521bp，Dm-dNK序列長度為779bp。由表達綠色熒光蛋白的野生5型腺病毒(Ad5-GFP)感染來確定病毒對細胞系的感染率。結(jié)果乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF7正常細胞系WI-38、MRC-5表現(xiàn)出基本相同的感染率。
　　二、Dm-dNK基因的表達及酶活性的

12、檢測
　　重組腺病毒ZD55-CMV-dNK感染細胞后的激酶活性檢測結(jié)果顯示感染后的乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7酶活性明顯高于沒有感染病毒的乳腺癌空白細胞系，也明顯高出重組腺病毒ZD55-CMV-dNK感染正常細胞MRC-5、WI38。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，重組腺病毒ZD55-CMV-dNK乳腺癌細胞Dm-dNK基因高表達，在正常細胞低表達。
　　三、Dm-dNK基因聯(lián)合核苷類似物對乳腺癌細胞的殺傷作用

13、>　　通過MTT及流式細胞儀檢測凋亡的體外實驗證實ZD55-CMV-dNK對乳腺癌細胞選擇性殺傷作用。MTT結(jié)果顯示:ZD55-CMV-dNK病毒和ZD55病毒分別感染乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7和正常細胞系MRC-5，WI-38，前者聯(lián)合Bvdu或Dfdc更能有效的殺傷乳腺癌細胞(p＜0.05)，然而在正常細胞中，ZD55-CMV-dNK與ZD55相比，二者聯(lián)合Bvdu或Dfdc對下常細胞MRC-5，WI-38殺傷效果

14、無差異(p＞0.05)。而且Dfdc比Bvdu對Dm-dNK的底物特異性更高。AnnexinⅤ-PI雙染流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)，ZD55-CMV-dNK感染后加Dfdc能夠誘導(dǎo)乳腺癌細胞MCF-7凋亡，而對正常細胞MRC-5影響輕微，對照空載病毒ZD55聯(lián)合Dfdc殺傷效果小。
　　四、ZD55-CMV-dNK聯(lián)合Dfdc或 Bvdu抑制腺病毒增殖
　　TCID50方法檢測病毒ZD500-CMV-dNK、ZD55、dl1520和

15、WtAd感染后的乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7和正常細胞系MRC-5，WI-38，加入不同化療藥物Dfdc和Bvdu，收集加藥后的細胞及上清檢測病毒滴度變化，在乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7中，ZD55-CMV-dNK聯(lián)合Dfdc和Bvdu治療病毒滴度均下降，而Dfdc下降最為明顯，其他病毒沒有發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)象。Western Blot方法對病毒早期轉(zhuǎn)錄單位E1A的檢測也證實了這一點。
　　五、Dm-dNK

16、基因聯(lián)合核苷類似物對裸鼠移植瘤的抑制作用
　　ZD55-CMV-dNK聯(lián)合Dfdc對裸鼠MCF-7/Bcap37乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移瘤治療。注射PBS的對照組腫瘤體積明顯增大，而注射腺病毒ZD55組，尤其是ZD55-CMV-dNK聯(lián)合Dfdc處理組腫瘤增長得到明顯抑制。體內(nèi)試驗結(jié)果與體外實驗相吻合。
　　六、ZD55-CMV-DNK聯(lián)合Dfdc延長移植瘤裸鼠生存期
　　ZD55-CMV-dNK/Dfdc系統(tǒng)對轉(zhuǎn)有DM-dNK

17、的乳腺癌MCF-7/Bcap37細胞轉(zhuǎn)移瘤治療后裸鼠的生存期較轉(zhuǎn)移瘤PBS處理組，轉(zhuǎn)移瘤ZD55處理組延長。
　　結(jié)論：
　　我們構(gòu)建的增殖型溶瘤腺病毒ZD55-dNK/dNKmu，能夠使Dm-dNK/dNKmu特異性的在乳腺癌細胞系中高水平表達，并保持蛋白激酶活性。同時，溶瘤病毒的瘤裂解作用，配合Dm-dNK持續(xù)磷酸化作為底物的核苷酸類似物BVDU和DFDC，可通過凋亡方式導(dǎo)致腫瘤細胞死亡，對正常細胞影響甚微。