病毒載體攜帶自殺基因Dm-dNK(果蠅脫氧核糖核苷酸激酶)對實體腫瘤雙重分子靶向治療的研究.pdf

1、目的：
　　 自殺基因輔以前藥治療(genedirectedenzymeprodrugtherapy,GDEPT)在近20年的研究中取得較大成績。廣泛應(yīng)用的基因治療系統(tǒng)為單純皰疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊環(huán)鳥苷(HSV-TK/GCV)系統(tǒng)。HSV-TK有著很高的催化效率,但HSV-TK/GCV得殺傷機制還未完全明確,而且HSV-TK/GCV系統(tǒng)用于自殺基因輔以前藥治療的主要缺點在于當其殺傷靶細胞后,有毒性的三磷酸化物GCV-TP會

2、殺傷臨近細胞。自殺基因輔以前藥治療綜合了分子治療,酶激活前藥治療,基因前藥治療,是基因治療的巨大進步,同時需要增強對前藥毒性的進一步控制。雖然在基礎(chǔ)實驗的治療效果被肯定,但自殺基因在臨床上的應(yīng)用有著殺傷效率有限及使用安全性問題。
　　 果蠅多底物脫氧核苷酸激酶基因(multisubstratedeoxyribonucleosidekinaseofDrosophilamelanogaster,Dm-dNK)能夠催化自然界所有嘌呤嘧

3、啶脫氧核糖核酸的磷酸化反應(yīng),除了其廣泛的底物特異性,這種激酶還表現(xiàn)出驚人的催化效率.要高出我們所曾了解的核酸激酶效率的10-100倍。在最近的實驗中,研究者試著使Dm-dNK在癌細胞種系中表達來起到一種自殺基因的作用,試驗成功證明這種酶在癌細胞表達的可能性以及其在癌細胞中酶活性的保持,不僅如此Dm-dNK還增加了癌細胞對某些化療藥物的敏感性。
　　 選擇復(fù)制性腺病毒(Conditionallyreplicatingadenovi

4、ruscs,CRAds),也稱為溶瘤腺病毒,它為惡性腫瘤的治療提供了一個新的平臺。選擇復(fù)制性腺病毒不但只感染腫瘤細胞并殺死它們,而且對正常細胞沒有殺傷效果。對實體腫瘤同樣效果明顯。選擇復(fù)制性腺病毒克服了傳統(tǒng)基因治療的缺點,包括感染率低,沒有特異性,殺傷效果差等。在放療,化療等傳統(tǒng)治療無能為力時,CRAds更好的詮釋了其自身的特點。然而,CRAds的復(fù)制有時難以控制,從而導(dǎo)致它在正常細胞中的復(fù)制并發(fā)生了副反應(yīng)。這就急需提高它的安全性及可控

5、性。
　　 我們構(gòu)建了新的病毒載體攜帶Dm-DNK,進一步我們在體外,體內(nèi)試驗中檢測Dm-DNK的抗腫瘤特性。
　　 方法：
　　 一、細胞培養(yǎng)
　　 腫瘤細胞系購買于上海細胞庫,正常細胞購買于ATCC.細胞使用L-15培養(yǎng)基或高糖DMEM培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有10%的血清,雙抗。培養(yǎng)環(huán)境為37℃,5%CO2.
　　 二、Westernblot檢測蛋白表達
　　 細胞均勻鋪于6孔板(5×105

6、cells/well),24小時后,給予病毒及前藥處理。48小時后,提取蛋白液。
　　 取1m110%分離膠溶液,加5ulTEMED后混勻,加入玻璃板內(nèi)底部聚合封口;將槽內(nèi)多余液體倒去,水洗3次,剩余9m1分離膠溶液加5ulTEMED混勻,注入玻璃板內(nèi),加水覆蓋;聚合完成后倒掉水覆蓋物,以10%的積層膠4ml,加入5ulTEMED混勻,注入分離膠上端:插入加樣梳,將凝膠玻璃板放入電泳槽,聚合5-6分鐘,緩慢拔去加樣梳,水洗加樣孔

7、;將樣品和SDS加樣緩沖液等比混合,100℃加熱3分鐘使蛋白變性,按順序加樣;50V電泳,至染料抵達分離膠與積層膠交界處;100V電泳,至染料抵達分離膠底部;將硝酸纖維薄膜漂浮于轉(zhuǎn)移緩沖液,借毛細作用濕潤,做好標記;將3MM濾紙浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液,取下凝膠置于硝酸纖維薄膜上,再置于6張3MM濾紙中間,400mA,電轉(zhuǎn)移30分鐘至硝酸纖維薄膜上:麗春紅S染液染色2分鐘,觀察轉(zhuǎn)膜情況,去離子水清洗,1xTBST平衡3次,每次5分鐘;封閉液封閉

8、1小時,1xTBST洗膜3次,每次5分鐘;加I抗反應(yīng),室溫1小時,1xTBST洗膜3次,每次5分鐘;加2抗,室溫反應(yīng)1小時,1xTBST洗膜三次,每次5分鐘;加入顯色液,每張膜上均勻鋪800ul,作HRP發(fā)光反應(yīng)反應(yīng)2分鐘。將膜倒置,貼于保鮮膜上,折疊,封好,貼于增感屏。在暗室中壓片,曝光于X-光片(Kodak公司),分別曝光30s-5min。
　　 三、酶活性檢測
　　 蛋白提取液用放射性[3H]標記作為底物的核苷酸藥

9、物,混合液在WhatmanDE-81濾紙上反應(yīng)不同時間后經(jīng)液閃測量儀測定放射活性。
　　 四、CPE實驗檢測細胞殺傷
　　 取對數(shù)生長期的腫瘤細胞及正常細胞,接種于24孔培養(yǎng)板中,24h細胞貼壁后,吸去上清,按MOI=0,0.1,1,10,100加入病毒,設(shè)實驗組及對照組。37℃,5%C02孵箱培養(yǎng)4h后洗去病毒液,每孔加1ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。48h后于倒置顯微鏡下觀察、拍照。
　　 五、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡<

10、br>　　 (1)對數(shù)生長期的細胞計數(shù)鋪板,按合適密度鋪板,分別感染病毒,同時設(shè)立陰性對照,37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)4h后洗去病毒液,每組加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。感染后24h加入前藥或PBS感染后48h結(jié)束實驗。
　　 (2)Annexin-V-FITC染色
　　 根據(jù)AnnexinV-FITC/PI試劑使用說明調(diào)整細胞為106個/ml,離心棄上清,加入10μlAnnexinV-FITC和5μlPI,輕搖勻,室溫避光反應(yīng)

11、15min,1h內(nèi)流式細胞儀檢測,各組細胞用流式細胞計量儀分別進行檢測。
　　 六、細胞殺傷實驗
　　 細胞按照一定密度鋪于96孔板,培養(yǎng)24小時后,給予病毒及前藥處理,48小時后,加入MTT(5mg/ml)20μl/孔,孵育4h后小心吸棄孔內(nèi)上清液,加入DMSO100μ1/孔,振蕩10min,酶標儀測定光密度值(OD570),取3孔平均值記錄結(jié)果。R450型酶標儀測570nm處光吸收值(OD570nm)。以不感染病毒細

12、胞的OD570nm為標準,其他孔的OD570nm與其相比即為該孔的細胞存活百分數(shù),而細胞殺傷率(%)=1-細胞存活百分數(shù)。
　　 七、裸鼠移植瘤實驗
　　 若干只Balb/c裸小鼠,右側(cè)腋下接種生長良好的腫瘤細胞懸液。待長出150-200mm3的腫瘤后,隨機分為治療組及對照組,隔天注射1次,注射10天后,腹腔注射前藥;對照組,腹腔注射PBS共注射10次。觀察裸鼠生存及腫瘤大小,用游標卡尺測量腫瘤短徑(a)、長徑(b),按

13、公式V=ab2/2計算腫瘤體積,按下式計算抑瘤率:抑瘤率=[(對照組腫瘤的平均體積.實驗組腫瘤的平均體積)/對照組腫瘤的平均體積]×100%
　　 結(jié)果：
　　 腫瘤細胞感染Dm-dNK后保持其酶活性。
　　 在腫瘤細胞中自殺基因和Dm-dNK聯(lián)合效應(yīng)殺傷腫瘤細胞的效果較單自殺基因殺傷腫瘤細胞效果明顯。
　　 感染Dm-dNK的正常細胞對照可以觀察到極低的酶活性,強烈的聯(lián)合殺傷效果只在腫瘤細胞中可以觀察到