shRNA抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa細(xì)胞Her-2-neu基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的：觀察質(zhì)粒載體介導(dǎo)的shRNA干擾技術(shù)能否有效抑制人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa HER—2基因的表達(dá)。RT-PCR法檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組之間轉(zhuǎn)染后mRNA水平之間是否有差異。Western Blot法檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組之間轉(zhuǎn)染后P185蛋白表達(dá)是否有差異。 方法：Ishikawa細(xì)胞購自于湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞研究所。利用Ambion公司提供的RNAi design tool設(shè)計(jì)出兩條針對HER—2/neu基因的特異性短發(fā)夾狀R

2、NA(shRNA)，GC比率在45％到55％之間。選用pSilencer4，1—CMV vectors(Ambion)作為質(zhì)粒載體，構(gòu)建兩條針對HER2基因的特異性重組質(zhì)粒。首先進(jìn)行細(xì)胞傳代，傳至足夠數(shù)量的細(xì)胞后凍存?zhèn)溆谩＠么竽c桿菌JM109作為感受態(tài)菌進(jìn)行大量的質(zhì)粒擴(kuò)增，以儲備足夠數(shù)量的質(zhì)粒，用lp2000作為媒介轉(zhuǎn)染Ishikawa細(xì)胞。試驗(yàn)分為三組，即shRNA—HER2—1組、shRNA—HER2—2組和表達(dá)非特異短發(fā)夾狀sh

3、RNA—CON的真核表達(dá)載體的陰性對照組。三組shRNA的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞后，RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染后24、48、72h HER2基因mRNA的表達(dá)。Western Blot法檢測轉(zhuǎn)染后24、48、72h HER2基因P185蛋白的表達(dá)，對比三組之間的差異。 結(jié)果：經(jīng)鑒定證實(shí)真核表達(dá)載體shRNA—HER2—1、shRNA—HER2—2與shRNA—CON均構(gòu)建成功。RT-PCR結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染后

4、24h、48h及72h后Her—2/neu1與Her—2/neu2組的mRNA水平分別下降為非特異Her—2/neu con組的70.1％和80.2％、60.2％和71.2％以及69.3％和78.5％，證實(shí)了兩特異重組質(zhì)粒在mRNA水平上均能抑制her—2基因的表達(dá)。而Western Blot法檢測P185蛋白水平分別下降為非特異Her—2/neu con組的79.1％和82.3％、57.2％和67.8％以及68.4％和73.3％，亦證