shRNA抑制小鼠肝癌細(xì)胞株JNK表達(dá)及與淋巴道轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究.pdf

1、背景：惡性腫瘤區(qū)別于良性腫瘤的根本特征是其轉(zhuǎn)移潛能。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡率高、預(yù)后差的根本原因，目前其發(fā)生機(jī)制尚不清楚，已成為當(dāng)今研究的重要課題。對(duì)于上皮來(lái)源的惡性腫瘤，其早期轉(zhuǎn)移的主要方式是淋巴道轉(zhuǎn)移，是影響患者預(yù)后的重要因素。因此，對(duì)于淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行研究，并在此基礎(chǔ)上建立起相應(yīng)的干預(yù)手段，將對(duì)惡性腫瘤患者具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。原發(fā)性肝細(xì)胞癌（primary hepatocellular carcinoma）是常見(jiàn)的惡性腫瘤之

2、一，在我國(guó)具有較高的發(fā)病率。盡管進(jìn)行了大量的研究與探討，但是肝癌轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)和機(jī)制尚不清楚。 Hca-F和Hca-P是一對(duì)來(lái)源于同一親本細(xì)胞，而且淋巴道轉(zhuǎn)移潛能顯著不同的小鼠肝癌腹水型細(xì)胞株。其中Hca-F是具有高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于70%，Hca-P是低轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞株，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率低于30%。這為研究淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了較為理想的細(xì)胞模型。 本實(shí)驗(yàn)組前期致力于小鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。在對(duì)Hca

3、-F細(xì)胞和Hca-P細(xì)胞的一系列研究中，利用抑制性消減雜交技術(shù)及高通量基因芯片技術(shù)篩選出了在Hca-F細(xì)胞和Hca-P細(xì)胞的差異表達(dá)基因；并采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立了高低淋巴道轉(zhuǎn)移力小鼠肝癌細(xì)胞熒光差異蛋白表達(dá)圖譜。其中在基因水平上，JNK在Hca-F細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于Hca-P細(xì)胞，提示JNK可能與小鼠肝癌的淋巴道轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)。由于在人類組織細(xì)胞中具有JNK同源蛋白，因此，研究小鼠肝癌細(xì)胞株JNK與淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系，對(duì)人類肝癌淋巴

4、道轉(zhuǎn)移的的防治具有重要意義。 c-Jun N端激酶（JNK）是一種能夠特異性磷酸化c-Jun的蛋白激酶，位于重要的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路-粘著斑（focal adhesion）通路上，是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的主要成員之一。MAPK是廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對(duì)于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能起著非常重要的作用，其本身及其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤有著密切的關(guān)系。JNK對(duì)于細(xì)胞發(fā)育，形態(tài)形成和分化是必需的。J

5、NK信號(hào)通路參與了多種生理過(guò)程，同時(shí)近來(lái)的研究表明JNK信號(hào)途徑也參與某些疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，使JNK在臨床上可做為一個(gè)潛在的分子治療靶點(diǎn)。本研究以JNK為研究對(duì)象，探索其在Hca-F細(xì)胞株淋巴道轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。經(jīng)檢索，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)JNK與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究報(bào)道。 目的： 1．從蛋白質(zhì)水平上比較JNK在淋巴道轉(zhuǎn)移潛能不同小鼠肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 2．構(gòu)建p

6、Silencer-shRNA表達(dá)載體，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hca-F細(xì)胞獲得JNK的表達(dá)水平顯著下調(diào)的Hca-F細(xì)胞株。 3．研究JNK表達(dá)水平的下降對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞株Hca-F在細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和侵襲能力等方面的影響，由此確定JNK表達(dá)水平與小鼠肝癌細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移潛能間的關(guān)系。 方法： 1．采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)磷酸化JNK（p-JNK）在Hca-F、Hca-P細(xì)胞株中表達(dá)有無(wú)差異。 2．由上海之江生物公司依據(jù)G

7、ene Bank中小鼠JNK基因序列（序列登錄號(hào)：NM_016700．3）設(shè)計(jì)shRNA靶序列，合成3條shRNA的DNA模板的兩條單鏈，分別命名為shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3，同時(shí)設(shè)計(jì)shRNA-無(wú)關(guān)序列。獲取pSilencerTM3．1-H1neo質(zhì)粒，然后對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，shRNA合成序列退火，T4 DNA ligase連接質(zhì)粒與三條shRNA的DNA模板和無(wú)關(guān)序列的退火后產(chǎn)物，連接產(chǎn)物分別命名為 pSilen

8、cer-shRNA-1、 pSilencer-shRNA-2、 pSilencer-shRNA-3、pSilencer-shRNA-無(wú)關(guān)序列。pSilencer-shRNA質(zhì)粒抽提獲得表達(dá)載體，對(duì)三條pSilencer-shRNA表達(dá)載體經(jīng)測(cè)序鑒定（引物為5'-GTTTTCCCA GTCACGAC-3'），結(jié)果與設(shè)計(jì)的三條shRNA靶序列和Gene Bank中序列比對(duì)。確定序列無(wú)誤后，將三條pSilencer-shRNA表達(dá)載體和無(wú)關(guān)序

9、列分別以脂質(zhì)體法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hca-F細(xì)胞，用含400ug/mlG418的完全培養(yǎng)基篩選，獲得pSilencer-shRNA表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hca-F細(xì)胞和無(wú)關(guān)序列對(duì)照組細(xì)胞。在mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)三條shRNA對(duì)JNK的表達(dá)的抑制作用，同時(shí)設(shè)RNAi陰性對(duì)照組（穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSilencer-shRNA-無(wú)關(guān)序列的Hca-F細(xì)胞株）以及陽(yáng)性對(duì)照組（正常的Hca-F細(xì)胞株），以篩選出RNAi效果最好的shRNA，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 3

10、．以三組細(xì)胞（分別為Hca-F細(xì)胞株、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSilencer-shRNA-無(wú)關(guān)序列的Hca-F細(xì)胞株、經(jīng)篩選的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSilencer-shRNA表達(dá)載體的Hca-F細(xì)胞株）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。以CCK-8法檢測(cè)三組細(xì)胞的細(xì)胞活力和分裂增殖能力；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)pSilencer-shRNA轉(zhuǎn)染Hca-F細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞遷移能力和侵襲能力的影響。 結(jié)果： 1．p-JNK在小鼠腹水型肝癌細(xì)胞系Hca-F和Hca-P均有

11、表達(dá)，在Hca-F細(xì)胞株中的表達(dá)顯著高于Hca-P，二者間有顯著性差異。 2．成功構(gòu)建pSilencer-shRNA表達(dá)載體并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hca-F細(xì)胞，3個(gè)表達(dá)載體中所含3條shRNA序列被正確檢測(cè)出，靶序列與GenBank中序列一致。經(jīng)篩選pSilencer-shRNA-2對(duì)JNK表達(dá)抑制的效果最好，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株中JNK在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)遠(yuǎn)低于其他2組及無(wú)關(guān)序列組和Hca-F細(xì)胞組，pSilencer-shRNA-2被

12、選擇作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的JNK穩(wěn)定下調(diào)的細(xì)胞株。 3．CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明JNK有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用：體外遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，JNK下調(diào)組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于陽(yáng)性和陰性對(duì)照組；體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，JNK下調(diào)組穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)明顯低于陽(yáng)性和陰性對(duì)照組。說(shuō)明在Hca-F中下調(diào)JNK表達(dá)之后，其遷移能力、侵襲能力均顯著下降。 結(jié)論： 1．p-JNK在小鼠腹水型肝癌細(xì)胞系Hca-F和Hca-P均有表達(dá)，在Hca-F細(xì)胞

13、株中的表達(dá)顯著高于Hca-P，二者間有顯著性差異。 2．利用pSilencerTM3．1-H1 neo質(zhì)粒和shRNA成功構(gòu)建了三個(gè)pSilencer-shRNA表達(dá)載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Hca-F細(xì)胞株，獲得JNK表達(dá)穩(wěn)定下調(diào)的Hca-F細(xì)胞株，經(jīng)過(guò)篩選pSilencer-shRNA-2對(duì)Hca-F細(xì)胞中JNK抑制效果最明顯，可作為后續(xù)研究的細(xì)胞株，為通過(guò)下調(diào)JNK在Hca-F的表達(dá)以研究JNK與肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的關(guān)系打下了基礎(chǔ)。