Ups-fucoidan抑制小鼠肝癌Hca-F細(xì)胞淋巴道轉(zhuǎn)移的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的:惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移是腫瘤患者致死的主要原因，腫瘤轉(zhuǎn)移是由多基因控制的多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程，并與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、黏附，血管轉(zhuǎn)移及淋巴管轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是富含硫酸基團(tuán)，并具有多種生物學(xué)活性的酸性雜多糖。而裙帶菜孢子葉來(lái)源的褐藻多糖硫酸酯(Ups-fucoidan)含有較高的硫酸根集團(tuán)而具有更強(qiáng)的生物學(xué)活性，如:抗腫瘤、抗凝血、抗炎、誘導(dǎo)凋亡、免疫調(diào)節(jié)等，其中，Ups-fucoidan

2、的抗腫瘤活性成為了近年來(lái)抗腫瘤研究的熱點(diǎn)。
　　腫瘤細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中產(chǎn)生的相關(guān)分子，可刺激自身增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的降解及與淋巴結(jié)的黏附，進(jìn)而促進(jìn)其經(jīng)淋巴道轉(zhuǎn)移。本研究對(duì)這些具有重要生物學(xué)功能的蛋白分子的表達(dá)量進(jìn)行分析，探究腫瘤細(xì)胞淋巴管轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，這些相關(guān)分子包括:在細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期調(diào)控起重要作用的細(xì)胞周期蛋白(cyclin D1)及其調(diào)控激酶(CDK4)，與降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和腫瘤侵襲密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶

3、家族(MMPs)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)，以及細(xì)胞與胞外基質(zhì)及淋巴結(jié)黏附相關(guān)的黏附因子，如:整合素家族(Integrin)，CD44及L-選擇素(L-Selectin)等。此外，核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)作為核內(nèi)重要的調(diào)控因子，對(duì)多種蛋白的表達(dá)和活化具有調(diào)控作用，其活性依賴于磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)及細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)等信號(hào)通路的調(diào)節(jié);血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGF-C)與其受體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因

4、子受體3(VEGFR-3)結(jié)合，可激活VEGF-C/VEGFR-3通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游Akt和ERK信號(hào)通路的活化。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)與其受體受體酪氨酸激酶(C-Met)結(jié)合，會(huì)激活其下游ERK信號(hào)通路，進(jìn)而對(duì)NF-κB起調(diào)控作用，NF-κB的活性變化與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　我們前期從海洋褐藻Undaria pinnatifida孢子葉中分離純化了Ups-fucoidan，并進(jìn)行了理化性質(zhì)分析。本研究以具有高淋

5、巴道轉(zhuǎn)移潛能的小鼠肝癌Hca-F細(xì)胞作為細(xì)胞模型，探討Ups-fucoidan對(duì)Hca-F細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及抑制淋巴道轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。
　　方法:1.采用MTT法檢測(cè)不同濃度Ups-fucoidan在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠肝癌Hca-F細(xì)胞增殖能力的影響，及增殖抑制率的變化。流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western blot法檢測(cè)Hca-F細(xì)胞對(duì)cyclin D1，CDK4表達(dá)的變化。

6、r>　　2.采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)不同濃度Fucoidan處理Hca-F細(xì)胞24h后細(xì)胞的存活率，進(jìn)而排除Ups-fucoidan的細(xì)胞毒作用。
　　3.通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)觀察Ups-fucoidan對(duì)Hca-F細(xì)胞遷移及侵襲能力的干預(yù)作用，并采用ELISA法檢測(cè)其分泌MMP-2，MMP-9水平的變化，Western blot法檢測(cè)TIMP-1，TIMP-3的表達(dá)水平。
　　4.冰凍淋巴結(jié)黏附實(shí)驗(yàn)觀察Ups-fucoi

7、dan對(duì)Hca-F細(xì)胞與淋巴結(jié)(Lymph node，LN)黏附能力的影響，Western blot法檢測(cè)其對(duì)Hca-F細(xì)胞總蛋白中Integrinα5-β1，CD44，L-Selectin等相關(guān)黏附因子表達(dá)水平的影響。
　　5.Western blot法檢測(cè)Hca-F細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白中VEGFR-3，C-Met，PI3K/Akt，ERK和NF-κB等通路中信號(hào)分子的蛋白表達(dá)水平變化，ELISA法檢測(cè)Hca-F細(xì)胞胞外分泌HGF，V

8、EGF-C的水平，半定量RT-PCR法檢測(cè)timp-1，ve gfc和vegfr-3mRNA表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ups-fucoidan可抑制Hca-F細(xì)胞增殖，其抑制作用具有時(shí)間劑量依賴關(guān)系，Annexin V/PI雙染結(jié)果表明Ups-fucoidan實(shí)驗(yàn)組可顯著促進(jìn)Hca-F細(xì)胞凋亡，并且Ups-fucoidan干預(yù)后cyclin D1和CDK4的表達(dá)量降低。
　　2.Ups-fucoida

9、n處理Hca-F細(xì)胞后，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)死亡細(xì)胞，同對(duì)照組相比，計(jì)算實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的相對(duì)死亡率，結(jié)果顯示各組細(xì)胞死亡率均小于5.2％，表明Ups-fucoidan對(duì)Hca-F細(xì)胞增殖及存活的抑制并非細(xì)胞毒作用。
　　3.Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ups-fucoidan減弱Hca-F細(xì)胞體外遷移及侵襲能力，ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Hca-F細(xì)胞分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中MMP-2，MMP-9的含量下降，但同對(duì)照組相比無(wú)顯著差異;We

10、stern blot結(jié)果表明，Ups-fucoidan干預(yù)后，TIMP-1和TIMP-3蛋白表達(dá)水平均顯著上升，并具有濃度依賴關(guān)系。
　　4.黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ups-fucoidan可減弱Hca-F細(xì)胞對(duì)LN的黏附能力，1000μg/ml實(shí)驗(yàn)組作用效果更為顯著，Western blot結(jié)果表明，Ups-fucoidan干預(yù)后Integrinα5-β1，CD44和L-Selectin等黏附因子的表達(dá)均下調(diào)。
　　5.Ups-

11、fucoidan干預(yù)后，Hca-F細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白中VEGFR-3，C-Met，PI3K/Akt，ERK，NF-κB信號(hào)通路中信號(hào)分子的蛋白表達(dá)水平均降低，并具有濃度依賴關(guān)系;ELISA結(jié)果表明，同對(duì)照組相比，處理組Hca-F細(xì)胞分泌VEGF-C和HGF的水平顯著下降， vegf-c和vegfr-3 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，timp-1 mRNA表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ups-fucoidan能抑制Hca-F細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、