CRKL過表達抑制小鼠肝癌Hca-P細胞體外增殖，遷移和侵襲能力.pdf

1、背景:轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤主要生物學特征，涉及細胞外基質(zhì)降解和細胞遷移等復雜過程，一直是腫瘤防治的重大課題和難點。淋巴結(jié)通常是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的第一個器官，惡性腫瘤早期淋巴道轉(zhuǎn)移是患者死亡率高預后性差的重要原因，是一個涉及多基因、多步驟的復雜過程，包括腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲等生物學過程，其轉(zhuǎn)移機制不清。
　　小鼠肝癌腹水型細胞株Hca-P和Hca-F是一對小鼠肝癌亞克隆細胞系，它們的遺傳背景相同，但淋巴道轉(zhuǎn)移潛能是顯著不同的，其中Hca

2、-P為低淋巴道轉(zhuǎn)移力細胞（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約25％），Hca-F為高淋巴道轉(zhuǎn)移力細胞（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約75％），是研究腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的理想細胞模型。
　　信號接頭蛋白CRKL，是CRK家族成員之一，在真核生物體內(nèi)廣泛表達，參與多種致癌信號通路，與一些癌癥的臨床病理學特征及預后密切相關(guān)，已成為腫瘤學研究的熱點分子。本課題組前期采用Westem blot技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CRKL在Hca-P中的表達是Hca-F中的3.05倍（P＜0.05），并

3、通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)Hca-P細胞CRKL表達水平，發(fā)現(xiàn)CRKL下調(diào)明顯促進Hca-P細胞淋巴道轉(zhuǎn)移潛能，提示CRKL的表達水平與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能是潛在的抑制肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的靶標分子。
　　目的:1.構(gòu)建pcDNA3.1-V5/HisB-CRKL和pEGFP-N1-CRKL真核表達質(zhì)粒;2.瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-CRKL質(zhì)粒至小鼠肝癌Hca-P細胞，激光共聚焦定位CRKL-GFP融合蛋白;3.瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3

4、.1-V5/HisB-CRKL質(zhì)粒至小鼠肝癌Hca-P細胞，Western blot檢測CRKL蛋白過表達水平;4.探究瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-V5/HisB-CRKL質(zhì)粒后，CRKL過表達對Hca-P細胞體外增殖、遷移、侵襲及克隆形成能力的影響，為進一步研究淋巴道轉(zhuǎn)移機制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:1.根據(jù)CRKL的CDS及pcDNA3.1/V5-HisB和pEGFP-N1載體，對應(yīng)設(shè)計引物對-1和引物對-2;2.RT-PCR方法擴

5、增小鼠CRKL的CDS全長，產(chǎn)物純化后與pEASY-blunt simple cloning vector進行克隆，獲得原核克隆質(zhì)粒pEASY-blunt simple-CRKL-1和pEASY-blunt simple-CRKL-2，分別進行單雙酶切及測序鑒定。將原核克隆質(zhì)粒、pcDNA3.1/V5-HisB和pEGFP-N1空質(zhì)粒分別進行雙酶切，純化目的片段并連接，獲得pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL和pEGFP-N1-C

6、RKL真核表達質(zhì)粒，并分別進行單雙酶切及測序鑒定;3.采用Lipofectamine(R)2000轉(zhuǎn)染試劑，將pEGFP-N1-CRKL及pEGFP-N1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠肝癌Hca-P細胞，轉(zhuǎn)染24小時后，倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，激光共聚焦顯微鏡定位CRKL-GFP融合蛋白;4.采用Lipofectamine(R)2000轉(zhuǎn)染試劑，將pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL及pcDNA3.1/V5-HisB空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠肝癌H

7、ca-P細胞，轉(zhuǎn)染24小時后，采用Western blot檢測CRKL蛋白過表達水平;5.CCK-8法檢測CRKL表達上調(diào)對Hca-P細胞增殖能力的影響，軟瓊脂克隆形成法檢測CRKL表達上調(diào)對Hca-P細胞克隆形成能力的影響，Transwell小室法檢測CRKL表達上調(diào)對Hca-P細胞體外遷移和侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:1.酶切及測序結(jié)果顯示，pEASY-blunt simple-CRKL-1和pEASY-bluntsimple

8、-CRKL-2克隆質(zhì)粒、pcDNA3.1-V5/HisB-CRKL和pEGF P-N1-CRKL真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功，重組質(zhì)粒中CRKL序列完全正確;2.激光共聚焦結(jié)果顯示，CRKL蛋白主要表達于細胞質(zhì)中;3.Western blot結(jié)果顯示，與pcDNA3.1/V5-HisB-Hca-P和Hca-P組相比，pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL-Hca-P組CRKL與CRKL-His總表達水平分別上調(diào)了1.69和1.39倍，且只有

9、pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL-Hca-P組檢測到CRKL-His Tag融合蛋白;4.CCK-8細胞增殖結(jié)果顯示，pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL-Hca-P與對照組相比細胞增殖速度明顯減慢;軟瓊脂克隆形成結(jié)果顯示，pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL-Hca-P與對照組相比細胞克隆形成能力明顯降低;Transwell小室結(jié)果顯示，pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL-Hca-P與對照組細胞相比細胞遷

10、移以及細胞侵襲能力顯著下降。
　　結(jié)論:1.成功構(gòu)建了pEASY-blunt simple-CRKL-1和pEASY-blunt simple-CRKL-2克隆質(zhì)粒;成功構(gòu)建了pcDNA3.1/V5-HisB-CRKL和pEGFP-N1-CRKL真核表達質(zhì)粒;2.CRKL蛋白主要分布于Hca-P細胞質(zhì)中;3.CRKL過表達抑制Hca-P細胞的增殖能力;4.CRKL過表達抑制Hca-P細胞的克隆形成能力;5.CRKL過表達抑制Hca