ATX-shRNA質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建及其對肝癌細胞體外增殖和運動能力的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建ATX基因短發(fā)夾狀RNA(shRNA)質(zhì)粒表達載體，研究其對人MHCC-97肝癌細胞ATx基因表達、增殖和運動能力的抑制作用，探索RNAi用于肝癌治療的新途徑。 方法： 1.設(shè)計合成含有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的ATX-shRNA對應(yīng)模板DNA序列兩對及隨機陰性對照，煺火處理后克隆至pSliencer 2.1-U6質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSlienc-er-ATX。 2.培養(yǎng)人肝癌MHCC-97細胞株，在陽離子脂質(zhì)體的介

2、導(dǎo)下將pSliencer-ATX 轉(zhuǎn)染人肝癌MHCC-97細胞。 3.實驗分空白組、脂質(zhì)體組、陰性對照組、實驗組。 4.分別于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5、7天收集細胞。 5.RT-PCR檢測 ATX mRNA的表達。 6.MTT方法檢測細胞增殖。 8.腫瘤細胞運動實驗檢測肝癌細胞運動能力的變化。 結(jié)果： 1.酶切及測序證實質(zhì)粒表達載體pSliencer-ATx構(gòu)建成功。

3、2.ATX-shRNA可顯著抑制人Ml-Ice-97肝癌細胞ATX mRNA的表達，半定量RT-PCR檢測顯示ATXmRNA的表達在轉(zhuǎn)染后第一天開始降低，第四天抑制作用最明顯，第五天抑制作用減弱。檢測顯示shRNA轉(zhuǎn)染肝癌細胞第四天ATX mRNA的表達較空白組受到明顯抑制[73.7±4.5]％(P<0.01)。 3抑制細胞的增殖：與空白對照相比，轉(zhuǎn)染ATX-shRNA后顯著抑制肝癌細胞的增殖[63.3±5.3]％(P<0.05

4、)。 4．細胞的侵襲力減弱：與空白對照相比，轉(zhuǎn)染ATX-shRNA后肝癌細胞穿過人工基底膜的個數(shù)明顯減少[(98±10)vs(222±12)](P<0.01)，表明侵襲力明顯減弱。 5．細胞運動能力減弱：與空白對照相比，轉(zhuǎn)染ATX-shRNA后肝癌細胞穿過Tran-swell小室濾膜的個數(shù)明顯減少[(18l±6)vs(379±7)](P<0.01)，表明運動能力明顯減弱。 6．ATx-shRNA轉(zhuǎn)染腫瘤細胞誘導(dǎo)A