Survivin shRNA載體的構建及其對大腸癌細胞體內外作用的研究.pdf

1、背景和目的： 大腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，且發(fā)病率有逐年增加的趨勢，在美國是導致惡性腫瘤死亡的第二大原因，且每年的發(fā)病人數達到135，000人。隨著我國人民生活水平的提高，膳食結構的改變，大腸癌的發(fā)病率也逐年提高，發(fā)病率已占惡性腫瘤的第三位，嚴重威脅人類的健康。 目前絕大多數的大腸癌仍采取手術為主的綜合治療，隨著治療水平的提高，大腸癌的術后復發(fā)、轉移逐步下降，但綜合治療的費用較高，副作用多，局部復發(fā)和肝轉移仍然是治

2、療失敗的主要原因，因此預防和早期發(fā)現局部復發(fā)和肝轉移，篩選高危患者，預測復發(fā)和轉移，以便及時治療，對提高患者的生存質量和生存率具有重要的意義。隨著分子生物學和基因工程的發(fā)展，基因治療正成為腫瘤防治研究的重點。目前，腫瘤的基因治療方法主要有基因替代，反義核酸技術，細胞因子基因治療以及近年來最為關注的RNA干擾技術，腫瘤基因治療的關鍵是找到合適的靶基因以及應用最先進的基因治療手段。 Survivin是新近發(fā)現的具有獨特結構的凋亡抑制

3、蛋白(1AP)家族的新成員，在許多惡性腫瘤中高表達，近年研究發(fā)現Survivin在正常大腸上皮細胞中不表達而在大腸癌中高表達，Survivin的表達上調與大腸癌的凋亡指數下降、總體存活率縮短、預后不良和復發(fā)率增加有關。鑒于它的獨特的生物學特點，Survivin有望成為腫瘤基因治療的理想靶點，許多研究顯示降低它的表達影響腫瘤細胞的生物學活性，對腫瘤的治療有利。RNA干擾是目前最有效的基因沉默技術，具有簡單、高效、特異的優(yōu)點，它主要通過核酸

4、酶將雙鏈RNA(dsKNA)切割成21-25nt的小干擾RNA，即siRNA，由siRNA按堿基配對的原則特異性的識別并切割同源性靶mRNA分子而實現。短發(fā)夾樣RNA(shorthairpinRNA,shRA)在細胞內會自動被加工成siRNA，使基因沉默，且比siRNA作用更穩(wěn)定，高效.本研究構建針對Survivin基因的特異性shRNA表達載體，探索針對Survivin基因的RNA干擾技術對大腸癌細胞系生物學功能的影響，構建裸鼠人大腸

5、癌動物模型，觀察其在體內對腫瘤的作用。 研究方法： 1、針對Survivin基因的一段靶序列：GGCTGGCTTCATCCACTGC(86-104)采用GeneChemTMsiRNA的設計工具，參照siRNA的設計原則，利用含綠色熒光蛋白的真核表達載體pGCsi-H1/Neo/GFP，構建真核表達質粒。兩條寡核苷酸經退火、限制性內切酶Hind和BamH1雙酶切、連接、轉化、PCR鑒定陽性克隆、構建pGCH1/Surviv

6、inshRNA表達質粒，測序驗證。 2、培養(yǎng)大腸癌細胞系SW480(Survivin高表達)，用非脂質體法將真核表達質粒轉染入SW480，并應用硫酸鹽G418進行篩選陽性克隆，轉染后以流式細胞儀、熒光顯微鏡、透射電鏡、Western-blot方法檢測腫瘤細胞的凋亡、轉染和細胞周期及Survivin蛋白的表達情況。 3、MTT法測定質粒轉染后SW480細胞的增殖情況。 4、Transwell小室法測定對細胞遷移能力

7、的影響。 5、將SW480細胞和轉染pGCH1/SurvivinshRNA的SW480細胞分別接種裸鼠皮下，建立裸鼠人大腸癌荷瘤模型，觀察shRNA-Survivin對成瘤性的影響。 6、采用雙盲法定期測量皮下腫瘤結節(jié)的二維值，計算每個腫瘤的體積和各組平均體積變化的差值，計算腫瘤抑制率。 7、免疫組織化學法測定Survivin蛋白的表達情況。 8、TUNEL法和透射電鏡檢測腫瘤細胞凋亡情況。 9、

8、顯微鏡下觀察肝，腎，肺等組織變化并測定血常規(guī)，了解siRNA對裸鼠血液系統(tǒng)，肝，腎，肺等器官的影響。 結果： 1、成功構建了重組質粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin，經測序顯示重組質粒shRNA編碼序列與我們設計的靶向Survivin的核苷酸序列完全一致。 2、綠色熒光蛋白載體構建的真核表達質粒瞬時轉染SW480細胞，G418篩選獲得了穩(wěn)定轉染的細胞株。熒光顯微鏡觀察轉染效率達90％以上，流式細

9、胞儀分析和透射電鏡顯示轉染后的細胞出現了細胞周期的變化(G2/M期增高)和凋亡的出現(細胞核內的染色質聚集，核內呈團塊狀，可見凋亡小體)。Western-blot分析轉染后的細胞Survivin蛋白的表達受到抑制，轉染后48小時和穩(wěn)定轉染后Survivin蛋白的表達分別被下調了52.1％、73.6％、45.8％、41.7％，抑制的時間較長。 3、MTT測定顯示轉染重組質粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin后細胞的

10、增殖受到抑制。 4、Transwell小室法分析細胞的遷移能力顯示轉染重組質粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin后的SW480細胞遷移能力較未轉染和轉染陰性質粒的SW480細胞明顯下降，抑制率為44.08％。 5、接種轉染細胞的裸鼠成瘤能力較未轉染的裸鼠成瘤能力降低，成瘤時間延長，瘤結節(jié)的體積小，抑瘤率為67.86％。 6、免疫組化測定轉染質粒的裸鼠移植瘤Survivin的表達降低，TUNEL法和

11、透射電鏡顯示凋亡增加，凋亡指數(17.25±3.30)％vs(5.48±1.38)％，(P<0.05)。 7、轉染質粒的安全性分析顯示，轉染后的裸鼠與未轉染組重要臟器的結構和功能以及血液系統(tǒng)都未受到影響。 結論： 1、成功構建了重組質粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin. 2、靶向Survivin的shRNA表達載體可以較長時間抑制Survivin蛋白的表達；抑制大腸癌細胞的增殖，誘導細胞

12、的凋亡，改變了細胞周期。 3、轉染重組質粒后的SW480細胞遷移能力明顯下降，說明Survivin除了抗凋亡和調節(jié)細胞周期的作用外，還可能參與和影響了腫瘤的轉移過程，降低Survivin的表達還可能抑制腫瘤的轉移。 4、SW480細胞可成功在裸鼠身上建立大腸癌模型。 5、事先轉染特異的shRNA-Survivin的大腸癌SW480細胞成瘤性差，重組質粒pGCsi-H1/Neo/GFP-Survivin.能抑制大腸