Survivin基因C端肽段Dominant-Negative對于大腸癌細胞株治療的研究.pdf

1、目的/背景：我國結(jié)直腸癌的死亡率隨著生活水平的提高而不斷提高，已經(jīng)成為主要的惡性腫瘤死因之一。生物治療，包括免疫、基因治療等新興手段是趨勢及希望所在。成功的免疫、基因治療應(yīng)該是最大限度地殺傷腫瘤細胞而保護正常細胞的治療方法。成功的腫瘤免疫治療有賴于合適的腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-associated antigens，TAA)的選擇。一個理想的TAA應(yīng)該具備下述特征：1)TAA應(yīng)該在大部分腫瘤病人的大部分腫瘤細胞中有表達；2)TAA應(yīng)該

2、能夠誘導特異識別腫瘤而非正常細胞的T細胞；3)最重要的是，TAA應(yīng)該是腫瘤細胞賴于生存的重要分子?？惯@種TAA的免疫才可以克服腫瘤細胞因抗原變異而逃避免疫反應(yīng)，因為一旦丟失這種生存分子，腫瘤細胞就會死亡。Survivin就是符合上述條件的少數(shù)幾種分子之一。首先，Survivin的過表達見于大部分實體和血液腫瘤；其次，Survivin能夠激發(fā)特異的機體免疫反應(yīng)；第三，顧名思義，作為存活素的Survivin是腫瘤細胞生存的必需蛋白。這些發(fā)現(xiàn)

3、提示Survivin是一種良好的腫瘤一基因或免疫治療靶基因，能夠成為免疫治療中有價值的TAA，但表達Survivin蛋白的腫瘤細胞能夠在機體內(nèi)存活，說明該蛋白某些抗原決定簇也可能誘發(fā)機體的免疫耐受。因此保留Survivin致凋亡的關(guān)鍵片斷，并盡量去除非必要潛在免疫耐受片斷是充分利用Survivin來進行抗腫瘤治療的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)的C端Survivin序列含有大部分的Survivin基因的免疫活性多肽，同時具有第84位半胱氨酸(Cys)這

4、個關(guān)鍵位點。第84位半胱氨酸突變?yōu)楸彼釀t造成內(nèi)源性Survivin分子移位，引起細胞有絲分裂障礙(Mitotic catastrophe)和凋亡。以上研究表明第80氨基酸殘基以后的C端Survivin序列能夠介導其主要功能和免疫原性。可以作為腫瘤治療的新靶點。因此本研究的目的是：在以往克隆的全長Survivin野生型載體的基礎(chǔ)上構(gòu)建僅含C端62(81-142)個氨基酸殘基的表達載體(第84位突變或不突變)，評價其對大腸癌細胞株的治療作

5、用。 方法：1)運用PCR技術(shù)，從pCDNA3.1-sur(既往實驗已經(jīng)構(gòu)建完成)中擴增出第80位氨基酸殘基以后的C端Survivin序列，克隆入真核表達載體pEGFP-C1。構(gòu)建pEGFP-C1-Csur<'②>重組質(zhì)粒。通過測序與GeneBank目標序列比對；2)運用定點突變技術(shù)，將pEGFP-C1-Csur及pCDNA3.1-Msur/T34A<'③>(既往實驗已經(jīng)構(gòu)建完成)中的第84位半胱氨酸定點突變?yōu)楸彼帷?gòu)建真核

6、表達載體pEGFP-C1-MCsur/C84A<'④>及pCDNA3-1-Msur/T34A--C84A<'⑤>。通過測序與GeneBank目標序列比對；3)應(yīng)用半定量RT-PCR法、免疫蛋白印跡法檢測重組質(zhì)粒pCDNA3.1-sur、pCDNA3.1-Msur/T34A-C84A、pEGFP-C1-Csur、pEGFP-C1-MCsur/C84A C端Survivin mRNA及蛋白的表達情況；4)利用熒光顯微鏡結(jié)合熒光染料Hoech

7、st 33258檢測瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的大腸癌細胞株Lovo的凋亡情況；5)、應(yīng)用流式細胞儀測結(jié)合碘化丙啶定(Propidium Iodide，PI)檢測瞬時轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Lovo細胞的生長周期。 結(jié)果：1)擴增含有C端Survivin基因片斷，并克隆入真核表達載體pEGFP-C1，構(gòu)建成重組質(zhì)粒(pEGFP-C1-Csur)。重組質(zhì)粒(pEGFP-C1-Csur)經(jīng)雙酶切(HindⅢ/BamHⅠ)及PCR鑒定插入片斷大小正確，測

8、序鑒定與GeneBank中Survivin編碼序列比對同源性為100％。 2)定點突變重組質(zhì)粒pEGFP-C1-MCsur/C84A及pCDNA3.1-Msur/T34A-C84A通過測序與GeneBank目標序列比對，突變位點正確，突變成功。 3)各重組質(zhì)粒的半定量RT-PCR檢測及免疫蛋白印跡法檢測顯示表達重組質(zhì)粒mRNA以及蛋白的大小與預(yù)計相符。在半定量RT-PCR檢測中，若以Survivin灰度值/GAPDH灰度

9、值表達mRNA相對表達量，則Lovo(未處理)及空質(zhì)粒組僅顯示本底濃度(癌細胞本身是表達Survivin的)為0.246±0.023及0.263±0.011，重組質(zhì)粒pCDNA3.1-sur、pEOFP-C1-Csur、pEGFP-C1-MCsay/C84A、pCDNA3.1-Msur/T34A-C84A組的mRNA相對表達量分別為0.454±0.058、0.627±0.028、0.736±0.137、0.450±0.054，PCR產(chǎn)物

10、濃度明顯高于2對照組，P=0.00。在pEGFP-C1-Csur組及pEGFP-C1-MCsay/C84A組出現(xiàn)了31kd的融合蛋白條帶和16.5kd的Survivin條帶，而其他組只出現(xiàn)了Survivin條帶，說明pEGFP-C1-Csur組及pEGFP-C1-MCsay/C84A組C端sruivivn/EGFP融合蛋白表達成功。 4)Hoechst33258染色觀察凋亡發(fā)現(xiàn)瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-MCsur/C84A及pC

11、DNA3.1-Msay/T34A-C84A能促進Lovo細胞凋亡，瞬時轉(zhuǎn)染pCDNA3.1(+)、pCDNA3.1-say、pEGFP-C1-Csur不能明顯促進細胞凋亡。 5)PI染色觀察細胞周期發(fā)現(xiàn)Lovo(未處理)、空質(zhì)粒組、pCDNA3.1-sar組、pEGFP-C1-Csur組、pEGFP-Cl-MCsur/C84A組及pCDNA3.1-Msur/T34A-C84A組的G1細胞周期分別為(46.34±3.67)％、(4

12、2.38±1.60)％、(47.75±1.79)％、(48.81±4.60)％、(54.52±2.62)％、(60.52±1.30)％。其中前4組處于G1期的細胞百分數(shù)均明顯少于后2組(P=0.00)，同時瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-MCsur/C84A的Lovo細胞處于G1期的細百分數(shù)少于轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-Msur/T34A-C84A的Lovo細胞，P=0.024。 結(jié)論：1)應(yīng)用基因重組及定點突變技術(shù)成功構(gòu)建了pEGFP-

13、C1-Csay、pEGFP-C1-MCsur/C84A、pCDNA3.1-Msurfr34A--C84A真核表達載體，并在大腸癌細胞株Lovo中成功表達。 2)體外實驗證明第84位半胱氨酸(Cys)定點突變?yōu)楸彼?Ala)(C84A)的Survivin拮抗Lovo野生型Survivin基因抑制凋亡的作用，這種作用在C端Survivin基因C84A(pEGFP-C1-MCsay/C84A)以及全序列Survivin基因T34A/

14、C84A(pCDNA3.1-Msay/T34A-C84A)的情況下相似。而C端Survivin野生型基因(pEGFP-C1-Csay組)引起癌細胞凋亡的作用不明顯。Survivin基因在缺乏N端情況下至少仍然可以部分行使其凋亡抑制作用，而這種凋亡抑制作用可以被第84位的C84A所拮抗。 3)C84A將癌細胞阻滯于DNA合成前期(G1)，使細胞難以進入正常的有絲分裂期，細胞增殖減少。這種情況在pEGFP-C1-MCsur/C84A