納米高聚合物轉(zhuǎn)導survivin反義寡核苷酸對大腸癌的體內(nèi)殺傷作用研究.pdf

1、研究背景：
　　 大腸癌是最常見惡性腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢。我國年均新發(fā)大腸癌病例約13萬,并以年均4％的增幅不斷攀升；中國發(fā)達地區(qū)的大腸癌發(fā)病率較三十年前增長了兩倍多,已經(jīng)接近西方發(fā)達國家水平；而香港地區(qū)大腸癌發(fā)病率在2009年已超越肺癌成為第一大癌癥。目前對大腸癌的主要治療手段是以手術(shù)治療為主、放化療等多種治療手段相結(jié)合的綜合治療。隨著對大腸癌發(fā)生發(fā)展機制認識的逐步深入,當前正在進行分子靶點藥物、抗血管增生、基

2、因治療等多種新的治療方法研究。基因治療因其具有特異性、安全性、有效性的特點而受到越來越多的關(guān)注,基因治療己與手術(shù)、化療、放療共同構(gòu)成目前腫瘤治療的四種手段。
　　 現(xiàn)代腫瘤學研究發(fā)現(xiàn)細胞增殖和細胞凋亡失常是普遍現(xiàn)象,正常機體的修復和免疫監(jiān)視機制可以修正機體細胞發(fā)生的異常增生和變異,消除變異的細胞,防止腫瘤的發(fā)生。腫瘤的發(fā)生是細胞增殖與凋亡失衡所致,凋亡抑制是腫瘤發(fā)生的重要機制。對腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制研究表明,在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程

3、中,細胞凋亡起了非常重要的作用。在正常情況下,細胞遭受DNA損傷后,首先將啟動修復途徑進行修復。在細胞損傷無法修復時,細胞將啟動凋亡途徑進行自發(fā)性的程序性死亡。在凋亡途徑發(fā)生異常后,細胞將積累突變并最終發(fā)展為癌。凋亡通路的紊亂、促進凋亡因子的抑制、凋亡抑制因子過表達以及凋亡基因的表達失控都會導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。因此凋亡異常在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到舉足輕重的作用。
　　 凋亡的調(diào)節(jié)機制非常復雜,也是目前的分子生物學研究熱點。近年發(fā)

4、現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)是一類重要的分子水平的抗凋亡調(diào)節(jié)因子。IAP家族具有多種生物學功能,包括結(jié)合并抑制caspase蛋白,從而抑制細胞凋亡、參與細胞膜受體介導的信號傳導通路調(diào)節(jié)、參與細胞周期調(diào)控。它們的過度表達可以引起腫瘤細胞的抗凋亡作用,因而與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。IAP家族結(jié)構(gòu)功能相似,但組織分布差異很大。Survivin是IAP家族成員之一,且是迄今發(fā)現(xiàn)

5、的最強的凋亡抑制因子,survivin在癌組織中的表達與惡性腫瘤的侵襲性、預后均有一定關(guān)系。與其它的IAP家族成員不同,survivin在人胚胎組織中高度表達并參與胚胎發(fā)育過程中的組織分化和器官形成,在終末分化的成人組織中未有檢出,但廣泛表達于多種腫瘤組織。有研究顯示近乎所有的常見癌癥中,Survivin的mRNA和蛋白都有過量表達,這一普遍分布現(xiàn)象表明,Survivin基因在癌癥中處于失控的表達狀態(tài)。而且Survivin表達往往與腫瘤

6、降低的凋亡指數(shù)和增高的增殖活性有關(guān),表明Survivin可能是參與多數(shù)腫瘤發(fā)生的共同機制。由于在腫瘤組織中的特異性分布,Survivin已成為腫瘤基因治療的新的重要靶點。
　　 基因治療的最終目的是在一個合適的系統(tǒng)中高效表達外源基因,使遺傳物質(zhì)在轉(zhuǎn)導細胞中持久整合及穩(wěn)定表達。反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASODN)技術(shù)的基本原理是根據(jù)Watson-Crick堿基互補配對規(guī)律和核酸雜交原理,

7、設(shè)計出能與靶基因特定區(qū)域結(jié)合的互補反義寡核苷酸片段,與靶基因(DNA)或信使核糖核酸(mRNA)的特定序列相結(jié)合,以影響靶基因的表達,抑制或消除其功能,而其他基因的轉(zhuǎn)錄和表達則不受影響。其作用于遺傳信息的上游且能特異性地阻斷細胞內(nèi)單一基因的表達,而不影響其他基因的正常功能,因此所需劑量較小、藥效高,同時具有特異性強、低毒副作用等優(yōu)點。由于survivin只在胚胎和惡性腫瘤組織中表達,在正常組織中基本不表達,因此反義survivin基因治

8、療具有良好的靶向性、特異性及安全性。但ASODN是親水性的多聚陰離子聚合物,具有不易透過細胞膜、細胞難于吸收、胞內(nèi)積累少以及易受血漿和細胞內(nèi)的核酸酶降解的缺點,因此限制了其在臨床中的應(yīng)用。研制高效實用的載體傳遞ASODN,則有可能發(fā)揮反義survivin基因治療的優(yōu)勢,使以survivin為靶點的基因治療成為可能。
　　 要按設(shè)計的目標完成基因治療,尋找或研制有效的基因載體是重要的步驟之一。目前的病毒載體和非病毒脂質(zhì)體載體都存在

9、不同程度的缺陷,因而尋找一種理想的基因載體就成為當務(wù)之急。納米基因轉(zhuǎn)運體的研制是目前國際納米生物和腫瘤基因治療研究領(lǐng)域重要的前沿性課題。納米微粒((nanoparticles,NP)一般是指粒徑在10～100nm之間的超微固態(tài)膠狀粒子,其大小介于原子簇和微粒子之間,因而具有許多普通材料所不具備的特性,如表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、宏觀量子效應(yīng)和界面效應(yīng)等。以納米微粒作為基因轉(zhuǎn)移載體就是將DNA、RNA、寡核苷酸等生物活性分子包裹在納米微粒內(nèi)部

10、或吸附在其表面,通過一系列復雜的過程釋放出這些活性分子,從而發(fā)揮基因治療的作用。目前的研究及本團隊前期的實驗已證實采用納米微粒做為基因遞送系統(tǒng)具有許多優(yōu)越性:1)可生物降解材料制備的納米粒無毒,無免疫原性,與機體有良好的生物相容性；2)可控制基因釋放,延長其體內(nèi)表達的半衰期；3)可裝載多種基因,其容量理論上無限制,同時可附載基因表達促進劑；4)可實現(xiàn)外源基因的靶向性傳輸。因此,納米微粒是理想的體內(nèi)基因遞送系統(tǒng),具有良好的應(yīng)用前景。聚酰胺

11、-胺型樹狀大分子(polyamidoamine,PAMAM)是近年來國外開發(fā)的一類新型功能高聚合物分子,其分子在結(jié)構(gòu)上具有很多特性,如高度的幾何對稱性、精確的分子結(jié)構(gòu)、大量的官能團、分子內(nèi)存在空腔及分子鏈增長具有可控性等等。已有的研究表面,以PAMAM為載體均較其它陽離子載體(如脂質(zhì)體、多聚賴氨酸)有更高的基因轉(zhuǎn)移率；PAMAM-survivin-ASODN轉(zhuǎn)染復合物具有粒徑小、zeta電位高、基因包封率及載藥率高的特點,對基因有緩慢釋

12、放的作用并可抵御酶的降解。
　　 基于上述研究,本課題擬應(yīng)用PAMAM作為survivin-ASODN的載體,配制成納米轉(zhuǎn)染復合物,并通過實驗觀察survivin-ASODN對裸鼠大腸癌SW620細胞移植瘤的體內(nèi)抑瘤效應(yīng),為進一步開展大腸癌的基因治療研究提供新的思路。
　　 目的：
　　 研究PAMAM作為survivin-ASODN轉(zhuǎn)染載體的可行性并觀察經(jīng)PAMAM轉(zhuǎn)導的survivin-ASODN在裸鼠體內(nèi)的

13、抗腫瘤作用。
　　 方法
　　 一、PAMAM-survivin-ASODN轉(zhuǎn)染復合物的合成。
　　 二、PAMAM介導的survivin反義寡核苷酸對大腸癌SW620細胞裸鼠模型的體內(nèi)抑瘤效應(yīng)。
　　 采用BALB/C雌性裸鼠18只,4～6周齡,每只體重約16g,取對數(shù)生長期的SW620細胞(約4.0×106個/ml,0.5ml)接種于裸鼠腹部皮下,建立大腸癌動物模型,當腫瘤達直徑0.5cm時,將荷瘤裸

14、鼠隨機分為3組,A組:陰性對照組(瘤體及瘤周注射LipolifectmainTM2000與PAMAM)；B組:脂質(zhì)體-survivin-ASODN治療組(瘤體及瘤周注射脂質(zhì)體-survivin-ASODN轉(zhuǎn)染復合物)；C組:PAMAM-survivin-ASODN治療組(瘤體及瘤周注射PAMAM-survivin-ASODN轉(zhuǎn)染復合物)。治療前后測量腫瘤體積,治療結(jié)束后測腫瘤重量,計算腫瘤抑瘤率,觀察該治療體系的體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)。治療結(jié)束

15、后行腫瘤組織內(nèi)survivin基因表達的檢測,透射電鏡觀察腫瘤細胞的超微結(jié)構(gòu)變化及心、肝、肺、腎組織病理檢查。
　　 結(jié)論
　　 1.Survivin-ASODN對大腸癌裸鼠移植瘤具有明顯的抑制作用,PAMAM-survivin-ASODN轉(zhuǎn)染復合物較脂質(zhì)體-survivin-ASODN轉(zhuǎn)染復合物具有更強的抗腫瘤作用；
　　 2.Survivin在裸鼠移植瘤細胞中有高度表達,PAMAM介導轉(zhuǎn)染針對survivin