Anxa5表達(dá)上調(diào)增強鼠肝癌Hca-P淋巴道轉(zhuǎn)移潛能.pdf

1、背景:淋巴道轉(zhuǎn)移是影響惡性腫瘤患者預(yù)后和生存的主要因素，腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移機制的研究可為其臨床診斷和治療提供依據(jù)。Anxa5(Annexin A5，膜聯(lián)蛋白A5)是膜聯(lián)蛋白家族一員。Anxa5表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥性等密切相關(guān)。但Anxa5與腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究鮮有報道。本課題組前期采用基因芯片高通量篩選和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)對來源于同一鼠肝癌細(xì)胞克隆、遺傳背景相同但淋巴道轉(zhuǎn)移潛能顯著不同的亞克隆細(xì)胞系Hca-F（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

2、移率約75％）和Hca-P（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率約25％）的研究表明，Anxa5在Hca-F中的表達(dá)是其在Hca-P中的3.16倍，提示Anxa5可能是潛在促進鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移的蛋白。
　　目的:1.檢測Anxa5在Hca-P和Hca-F中的差異表達(dá);2.構(gòu)建pcDNA3.1-V5/HisB-Anxa5真核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染至Hca-P，篩選獲得Anxa5表達(dá)穩(wěn)定上調(diào)的Hca-P單克隆細(xì)胞株;3.觀察上調(diào)Anxa5后Hca-P細(xì)胞形態(tài)及亞顯

3、微結(jié)構(gòu)的變化;4.探究Anxa5表達(dá)上調(diào)對Hca-P體外增殖、遷移、侵襲及體內(nèi)成瘤性及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力的影響，為進一步研究淋巴道轉(zhuǎn)移機制提供新線索。
　　方法:1.Western blot檢測Anxa5在Hca-P和Hca-F中的表達(dá);2.RT-PCR方法擴增小鼠全長Anxa5編碼序列，并將構(gòu)建的pcDNA3.1-V5/HisB-Anxa5表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Hca-P，G418篩選及有限稀釋法獲得單克隆細(xì)胞株，同時建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA

4、3.1-V5/HisB空質(zhì)粒的Hca-P細(xì)胞株作為對照，Western blot檢測Anxa5表達(dá)穩(wěn)定上調(diào)的單克隆細(xì)胞株;3.倒置光學(xué)顯微鏡觀察Anxa5表達(dá)上調(diào)后Hca-P細(xì)胞形態(tài)的變化，透射電子顯微鏡觀察上調(diào)Anxa5后Hca-P細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)的變化;4.CCK-8法檢測上調(diào)Anxa5后Hca-P增殖能力變化，Transwell法檢測Anxa5表達(dá)上調(diào)對Hca-P體外遷移和侵襲能力的影響，通過小鼠足墊皮下注射分析Anxa5表達(dá)量變化

5、致Hca-P體內(nèi)成瘤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。
　　結(jié)果:1.Anxa5在Hca-F中的表達(dá)量是其在Hca-P中的～2.55倍;2.酶切及測序結(jié)果顯示，pMD(@)19-T-Anxa5克隆質(zhì)粒和pcDNA3.1-V5/HisB-Anxa5表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;3.Anxa5上調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞體積增大，細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體數(shù)量增加，線粒體腫脹，線粒體內(nèi)嵴減少，基質(zhì)密度降低;4.篩選獲得Anxa5表達(dá)穩(wěn)定上調(diào)的單克隆細(xì)胞株Anxa5-Hca-P-1

6、、Anxa5-Hca-P-2和Anxa5-Hca-P-3，與Control-Hca-P相比，Anxa5-Hca-P-1、Anxa5-Hca-P-2和Anxa5-Hca-P-3中Anxa5蛋白水平分別上調(diào)了15.0％、20.3％和67.7％;5.Anxa5-Hca-P-1、Anxa5-Hca-P-2相對于Control-Hca-P增殖明顯加快，Anxa5-Hca-P-3與Control-Hca-P相比增殖減慢;6.Anxa5-Hca-P-

7、1、Anxa5-Hca-P-2和Anxa5-Hca-P-3相比于Control-Hca-P的遷移能力分別提高了68.11％、60.15％和167.39％;7.與Control-Hca-P相比，Anxa5-Hca-P-1、Anxa5-Hca-P-2和Anxa5-Hca-P-3的侵襲能力分別提高了47.18％、57.57％和100.03％;8.Anxa5表達(dá)上調(diào)后各組間腫瘤大小無差異，但能促進腫瘤表觀惡性程度;9.Anxa5-Hca-P-1

8、組和Anxa5-Hca-P-3組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度明顯高于Control-Hca-P組，Anxa5-Hca-P-3組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度明顯高于Anxa5-Hca-P-1組。
　　結(jié)論:1.Anxa5在鼠肝癌淋巴道轉(zhuǎn)移細(xì)胞株Hca-P和Hca-F中均有表達(dá)，且在Hca-P中表達(dá)低于Hca-F;2.Anxa5表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞體積增大，細(xì)胞內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體數(shù)量增加，線粒體腫脹，線粒體內(nèi)嵴減少，基質(zhì)密度降低;3.Anxa5表達(dá)上調(diào)促進Hca-