ANXA5表達調控人肝癌HepG2細胞侵襲、轉移及順鉑耐藥性的作用及機制研究.pdf

1、背景:膜聯蛋白A5(Annexin A5，ANXA5)，在多種組織中普遍表達。ANXA5異常表達與多種惡性腫瘤相關;與原位肝癌組織相比，ANXA5在肝門靜脈瘤栓中高表達;在順鉑耐受的鼻咽癌細胞中也呈高表達。本課題組前期研究表明，ANXA5表達水平影響小鼠肝癌細胞(Hca-F/Hca-P)的增殖、遷移、侵襲等生物學功能，具有促進作用。本論文研究ANXA5影響人HepG2生物學行為及機制研究。
　　目的:1、構建pGPU6/GFP/N

2、eo-shRNA-ANXA5表達載體，利用脂質體穩(wěn)定轉染至HepG2中，篩選ANXA5表達穩(wěn)定下調單克隆細胞株及對照細胞株;2、研究ANXA5對HepG2體外增殖、遷移、侵襲、粘附、細胞骨架形成的影響及作用的分子機制;3、探究ANXA5對HepG2細胞cisplatin耐受性的影響。
　　方法:1、根據人源ANXA5的mRNA序列，設計特異性siRNA及無關序列，構建pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA5/NC表達載體

3、;2、利用LipofectamineTM2000轉染試劑轉染重組質粒至HepG2中，G418篩選及Western Blot驗證獲得ANXA5表達穩(wěn)定下調單克隆細胞株及對照細胞株;3、MTT法聯合平板克隆形成實驗探究ANXA5對HepG2體外增殖能力影響;4、Transwell小室法結合劃痕實驗探究ANXA5對HepG2體外遷移、侵襲能力影響;5、與細胞外基質、內皮細胞以及小鼠淋巴結粘附實驗探究ANXA5對HepG2粘附能力影響;6、對微

4、絲進行染色，探究ANXA5對HepG2細胞骨架影響;7、MTT法結合Hoechst33342染色法檢測ANXA5對HepG2順鉑(cisplatin)耐受性影響;8、Weatern Blot檢測ERK信號通路關鍵分子、c-Myc表達變化;9、qRT-PCR檢測E-Cadherin表達水平變化。
　　結果:1、構建了pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA5/NC表達載體，獲得ANXA5表達穩(wěn)定下調單克隆HepG2-shAN

5、XA5及陰性對照HepG2-shNC細胞株。與HepG2-shNC相比，HepG2-shANXA5中ANXA5下調近100％;2、HepG2-shANXA5較HepG2-shNC的增殖能力降低，平板克隆形成率降低24.7％;3、與HepG2-shNC相比，HepG2-shANXA5遷移能力降低70.0％;4、HepG2-shANXA5較HepG2-shNC侵襲能力降低85.0％;5、HepG2-shANXA5較HepG2-shNC對細胞

6、外基質、內皮細胞、小鼠淋巴結的粘附能力分別降低10.2％、30.2％、48.0％;6、ANXA5下調后，HepG2細胞actin骨架染色變淺，F-actin結構性降低排列紊亂;7、HepG2-shANXA5較HepG2-shNC對cisplatin敏感性明顯降低;8、與HepG2-shNC相比，HepG2-shANXA5中Raf、MEK1/2、ERK2的磷酸化水平降低，c-Myc蛋白水平降低，E-Cadherin mRNA水平升高。