干預Hrd1表達對A549細胞順鉑耐藥性的影響.pdf

1、目的：驗證抑制Hrd1的表達是否能夠強化ERS從而改變人肺癌耐順鉑細胞株（A549/DDP）的藥物敏感性。本實驗通過檢測Hrd1mRNA和蛋白質水平、ERSIA相關性因子表達來評價Hrd1與ERS強度的關系，并進一步探討內質網應激強度與順鉑敏感性的關系，為肺癌Hrd1生物靶向治療及化療增敏的可行性提供理論依據，同時為其它實體瘤的治療提供借鑒意義。
　　方法：體外培養(yǎng)肺腺癌A549細胞株；采用梯度濃度順鉑逐級誘導法體外建立人肺癌耐順

2、鉑細胞株（以下用A549/DDP表示）；MTT、CCK-8檢測細胞抑制效應；Transwell檢測細胞的侵襲能力；用攜帶有Hrd1siRNA的慢病毒載體轉染A549/DDP細胞；RT-PCR檢測Hrd1mRNA表達；Western-blot檢測 Hrd1、ERSIA相關因子的表達；流式細胞儀檢測轉染后細胞的周期及凋亡情況；
　　結果：
　　1.半數抑制濃度（IC50）計算
　　結果顯示：A549細胞對順鉑的IC50為0

3、.5 mg/L;而A549/DDP細胞對順鉑的IC50為1.0 mg/L。
　　2. MTT實驗結果
　　結果顯示：總的來說兩組的光度值（OD值）均隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，均從第二天開始增長加快，在第五天生長減慢，第七天趨近平緩。但處于快速增長的第二天與第三天，A549/DDP的OD值較A549小，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3. Transwell侵襲實驗結果
　　熒光顯微鏡（×200）下可見

4、：A549組隨著DDP濃度增加穿過小室的細胞數明顯減少，0mg/L組侵出小室的細胞數分別為1mg/L組的1.57倍和2mg/L組的5.37倍(P＜0.05)；A549/DDP組在2mg/L DDP作用時穿過小室的細胞數明顯減少，0mg/L、1mg/L DDP作用下穿過小室的細胞數無顯著差異(P＞0.05)，且穿過小室的細胞數分別為2mg/L組的2.92倍和2.75倍(P＜0.05)。
　　4.不同時間和濃度Hrd1蛋白的表達情況<

5、br>　　Western-blot顯示：Hrd1蛋白的表達在0.5、1 mg/L時表達最高，隨DDP濃度的增加表現為逐漸下降；1mg/l DDP處理時，Hrd1蛋白的表達在24h達到高峰，48h后趨于平緩.
　　5.轉染后Hrd1蛋白及mRNA表達情況
　　Western-blot結果顯示：與陰性病毒對照組（以下用空白轉染組表示）、耐藥組（以下用A549/DDP組表示）、未經藥物處理組（以下用A549組表示）相比較，病毒轉染

6、組（以下簡稱轉染組）的Hrd1mRNA及蛋白的表達量最低（P＜0.05），而空白轉染組與A549/DDP組Hrd1蛋白的表達量最高,兩者無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但與A549組比較有顯著差異（P＜0.05）。RT-PCR獲得相同的結果。
　　6.轉染后JNK、p-JNK、CHOP、Caspase-4表達情況
　　各組總 JNK蛋白表達無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；轉染組 p-JNK、CHOP、Caspase-4表達最高，

7、與其余三組相比有顯著性差異（P＜0.05），空白轉染組及A549/DDP組p-JNK、CHOP、Caspase-4的表達量基本相等，兩者相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），A549組表達最低。
　　7.流式檢測細胞周期結果
　　Hrd1抑制后，細胞明顯阻滯于S期，表現為隨著DDP濃度增加，細胞S期比例增加， G2-M呈下降趨勢。
　　8.流式檢測細胞凋亡結果
　　轉染組的細胞凋亡率明顯高于對照組（P＜0.05），且

8、隨DDP濃度增加而增加，空白轉染組與A549/DDP組在0mg/L、0.5mg/L DDP處理時，細胞均無明顯凋亡（P＞0.05），在2mg/L DDP處理時，細胞開始出現凋亡，與0 mg/L、0.5mg/L組比較，有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：
　　1.抑制A549/DDP細胞的Hrd1表達，可使細胞出現周期阻滯現象，并通過強化ERS，使A549/DDP細胞凋亡增加；
　　2.抑制Hrd1可改變A549細