耐藥性肺腺癌A549細胞能量代謝的初步研究.pdf

1、研究目的：
　　1.闡明耐藥性肺腺癌A549細胞的能量代謝狀態(tài)和主要產(chǎn)能途徑。
　　2.探究靶向上述產(chǎn)能途徑對化療藥物抗腫瘤效果的影響。
　　研究方法：
　　1.建立肺腺癌耐藥細胞系
　　1.1.利用順鉑濃度遞增的方法，誘導(dǎo)親本肺腺癌細胞A549建立人耐藥性肺腺癌細胞系A(chǔ)549/CR（cisplatin-resistant A549）；
　　1.2.利用MTS實驗驗證A549/CR的耐藥性。
　

2、　2.耐藥性肺腺癌A549細胞的能量代謝狀態(tài)和主要依賴的產(chǎn)能途徑
　　2.1.采用CellTiter-Glo?發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒，檢測A549與A549/CR細胞的ATP含量，了解耐藥性肺腺癌A549細胞的能量狀態(tài)；
　　2.2.利用熒光標記的葡萄糖類似物2-NBDG，比較A549與A549/CR細胞的葡萄糖攝取能力，反映耐藥性肺腺癌A549細胞的葡萄糖代謝狀態(tài)；
　　2.3.采用乳酸測定試劑盒，檢測A549與A

3、549/CR細胞的乳酸生成量，了解糖酵解的活化程度；
　　2.4.在下述不同條件下（1）單獨用糖酵解抑制劑2-DG處理，（2）單獨用氧化磷酸化抑制劑寡霉素處理，（3）聯(lián)合應(yīng)用2-DG和寡霉素處理，利用CellTiter-Glo?發(fā)光法細胞活力檢測試劑盒，觀察 A549與 A549/CR細胞ATP含量變化，反映兩群細胞對糖酵解和氧化磷酸化的依賴程度。
　　3.代謝抑制劑對耐藥細胞生存的影響
　　3.1.利用 MTS實驗分

4、別檢測濃度為0μmol/mL、10μmol/mL和20μmol/mL的2-DG對A549/CR細胞生存的影響；
　　3.2.聯(lián)合應(yīng)用不同濃度組合的2-DG和順鉑處理 A549/CR細胞，利用 MTS實驗檢測A549/CR細胞活力，反映耐藥細胞對順鉑的敏感性變化。
　　結(jié)果：
　　1.成功建立了肺腺癌耐藥細胞系A(chǔ)549/CR
　　1.1.順鉑連續(xù)處理三個月后，A549/CR細胞可在較高濃度（5μg/mL）順鉑的培養(yǎng)

5、基中維持生長；
　　1.2.MTS實驗結(jié)果顯示當順鉑濃度為40μg/mL時，A549/CR細胞的存活率比A549細胞高出約10％，差異有統(tǒng)計學意義(n=4，P<0.001)。
　　2.耐藥性肺腺癌A549細胞的能量水平較高，主要依賴糖酵解產(chǎn)生能量
　　2.1.A549/CR細胞的ATP含量顯著升高，約為A549細胞的1.8倍（n=4， P<0.001）；
　　2.2.葡萄糖攝取結(jié)果顯示A549/CR細胞的熒光強度

6、顯著高于A549細胞(n=4， P<0.05)，說明其攝取了更多的熒光標記的2-NBDG；
　　2.3.乳酸生成量結(jié)果顯示A549/CR細胞的乳酸生成量顯著升高，約為A549細胞的1.6倍（n=4，P<0.001）；
　　2.4.代謝抑制劑對ATP水平的影響如下：（1）單獨應(yīng)用2-DG處理細胞時， A549/CR細胞ATP含量下降了85%（n=3，P<0.001），說明其與A549相比對2-DG的敏感性更高，（2）單獨應(yīng)用寡

7、霉素處理細胞時，A549細胞的ATP水平下降了40%，（n=3，P<0.001），而A549/CR細胞僅下降不到10%；（3）聯(lián)合應(yīng)用2-DG與寡霉素處理細胞時，A549/CR和A549細胞ATP含量的變化趨勢與單獨應(yīng)用2-DG時幾乎相同，說明耐藥性肺腺癌A549細胞更依賴糖酵解，而幾乎不依賴氧化磷酸化。
　　3.代謝抑制劑對耐藥細胞生存的影響
　　3.1.通過MTS實驗可知低濃度（20μmol/mL以下）的2-DG對耐藥細

8、胞的增殖無明顯影響（n=4，P>0.05）；
　　3.2.聯(lián)合用藥結(jié)果顯示較低濃度（10μmol/mL）的2-DG與10μg/mL順鉑聯(lián)用可使耐藥細胞的死亡率增加80%（n=3，P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.耐藥性肺腺癌A549細胞具有更高的ATP水平。
　　2.耐藥性肺腺癌A549細胞主要依賴糖酵解產(chǎn)生能量。
　　3.糖酵解抑制劑可使耐藥性肺腺癌A549細胞恢復(fù)對順鉑的敏感性。
　　綜上所述