曲古抑菌素A聯(lián)合順鉑對(duì)肺腺癌A549凋亡的影響.pdf

1、表觀遺傳學(xué)是遺傳學(xué)分支學(xué)科，指在不改變DNA序列的前提下，基因或者蛋白表達(dá)發(fā)生變化，并可以在細(xì)胞的生長(zhǎng)和傳代過(guò)程中穩(wěn)定傳遞，主要包括組蛋白的共價(jià)修飾，DNA甲基化，基因沉默，染色質(zhì)重塑，以及非編碼RNA編輯等機(jī)制。表觀遺傳學(xué)與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系，腫瘤中存在表觀遺傳方式的異常。表觀遺傳學(xué)通過(guò)影響腫瘤抑制基因及其表達(dá)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。組蛋白組成了核小體，它可以被多種化合物所修飾，如磷酸化、乙?；图谆龋Q(chēng)為共價(jià)修飾，組蛋白的這些共

2、價(jià)修飾作用主要發(fā)生在其N(xiāo)2末端，其中最為重要的是組蛋白乙?；?，組蛋白乙?；瘯?huì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的染色體結(jié)構(gòu)以及基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，從而使腫瘤的治療更加樂(lè)觀。
　　組蛋白乙酰化和去乙?；诩?xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、分裂、凋亡、細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)、以及及染色體組裝等方面起著重要作用。各種抗腫瘤藥物有著不同的作用特點(diǎn)，不同類(lèi)型的腫瘤使用不同的抗腫瘤藥物，其作用機(jī)制各不相同，但多種針對(duì)實(shí)體瘤或血液系統(tǒng)腫瘤的抗腫瘤藥物均可與組蛋白去乙?；敢种苿┞?lián)合，起到協(xié)同

3、作用，研究發(fā)現(xiàn)，抗腫瘤藥物與組蛋白去乙?；敢种苿┞?lián)合后，比單藥使用抗腫瘤藥物組生存率高，對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用顯著，并且其療效有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　組蛋白去乙酰化酶抑制劑在惡性腫瘤的治療作用已受到廣泛認(rèn)可。組蛋白去乙?；敢种苿┠壳俺３Ｓ脕?lái)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、激素、化療藥物如紫杉醇及鉑類(lèi)等、酪氨酸激酶受體阻滯劑等藥物聯(lián)合使用。
　　目前在肺癌的研究中，組蛋白去乙酰化酶抑制劑聯(lián)合鉑類(lèi)藥物的報(bào)道較少，為研究組

4、蛋白去乙酰化酶抑制劑與順鉑聯(lián)合用藥，對(duì)肺癌細(xì)胞的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)一步探索，設(shè)計(jì)了本次的實(shí)驗(yàn)。
　　目的:研究曲古抑菌素A(trichostatinA，TSA)聯(lián)合順鉑(cisplatin)對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549凋亡的影響，以及藥物處理后A549細(xì)胞中cFLIP、caspase-8蛋白的表達(dá)情況。
　　方法:1、使用PRMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)肺腺癌A549細(xì)胞株，將細(xì)胞分為四組:1）、對(duì)照組2）、TSA250nmol/L

5、處理組3）、Cisplatin10μg/mL處理組4）、TSA250nmol/L+Cisplatin10μg/m L聯(lián)合處理組，藥物處理24h后，使用光學(xué)顯微鏡觀察各個(gè)組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。2、使用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞的抑制率，將細(xì)胞分為10組:1）、空白對(duì)照組2）、TSA250nmol/L處理組3）Cisplatin5.3μg/mL處理組4）TSA250nmol/L+ Cisplatin5.3μg/mL處理組5）Cis

6、platin9μg/m處理組6）TSA250nmol/L+Cisplatin9μg/mL處理組7）Cisplatin13μg/mL處理組8）TSA250nmol/L+ Cisplatin13μg/mL處理組9）Cisplatin20μg/mL處理組10）TSA250nmol/L+ Cisplatin20μg/mL處理組。測(cè)定不同濃度順鉑處理細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞抑制率，以及不同濃度順鉑聯(lián)合TSA處理細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞的抑制率。3、按照1中的分組方法

7、將細(xì)胞分為4組，使用Hoechst33258染色法顯示不同處理組細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)。4、按照1中的分組方法將細(xì)胞分為四組，使用Western blot法檢測(cè)cFLIP、Pro-caspase-8及Caspase-8蛋白表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS15軟件進(jìn)行x2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、光學(xué)顯微鏡下觀察四個(gè)組藥物處理后細(xì)胞形態(tài)的變化
　?、賹?duì)照組:細(xì)胞排列規(guī)則，緊密貼壁，細(xì)胞邊界清晰，未

8、看到懸浮死細(xì)胞。
　?、赥SA250nmol/L處理組:細(xì)胞變大，有些細(xì)胞呈并指狀，細(xì)胞間隙增大，可見(jiàn)少量懸浮死細(xì)胞。
　　③Cisplatin10μg/mL處理組:細(xì)胞比對(duì)照組變小、變圓，發(fā)生皺縮，可見(jiàn)較多死細(xì)胞。
　　④TSA250nmol/L+ cisplatin10μg/mL聯(lián)合處理組:與前三組相比，細(xì)胞密度明顯下降，細(xì)胞發(fā)生皺縮，可見(jiàn)大量死細(xì)胞懸浮。
　　2、四甲基偶氮唑鹽（MTT法）檢測(cè)不同濃度順鉑對(duì)

9、細(xì)胞的抑制作用，以及不同濃度順鉑聯(lián)合TSA對(duì)細(xì)胞的抑制作用
　　使用不同濃度的順鉑處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)順鉑對(duì)細(xì)胞的抑制作用與順鉑的濃度呈正相關(guān)。隨著順鉑濃度的增加，細(xì)胞凋亡率增加。當(dāng)聯(lián)合TSA后，各組對(duì)細(xì)胞的抑制率均升高。Cisplatin5.3μg/mL、TSA250nmol/L+ Cisplatin5.3μg/mL細(xì)胞抑制率分別為13.68％、26.42％。Cisplatin9μg/mL、TSA250nmol/L+ Cisplati

10、n9μg/mL細(xì)胞抑制率分別為28.73％、46.72％。Cisplatin13μg/mL、TSA250nmol/L+ Cisplatin13μg/mL細(xì)胞抑制率分別為44.58％、49.65％。Cisplatin20μg/mL、TSA250nmol/L+Cisplatin20μg/mL細(xì)胞抑制率分別為51.12％、61.92％。順鉑與TSA聯(lián)合對(duì)細(xì)胞的抑制明顯高于單藥組(p＜0.05)。
　　3、Hoechst33258染色法觀

11、察各組使用藥物處理后細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)
　　各個(gè)組藥物處理24h后，使用Hoeschst33258染色法觀察細(xì)胞的凋亡特點(diǎn)，相比于對(duì)照組，TSA及Cisplatin藥物單藥處理組凋亡細(xì)胞增多，出現(xiàn)染色質(zhì)凝集，核染色熒光增強(qiáng)，聯(lián)合用藥上述現(xiàn)象更加明顯，熒光度增強(qiáng)，并可以觀察到核裂解及凋亡小體。
　　4、TSA聯(lián)合Cisplatin對(duì)cFLIP蛋白表達(dá)量的影響
　　使用TSA250nmol/L聯(lián)合Cisplatin10μg/m

12、L處理細(xì)胞24h后，單藥處理組cFLIP蛋白表達(dá)量減少，相比對(duì)照組及單藥處理組，聯(lián)合用藥組cFLIP蛋白表達(dá)明顯減少。測(cè)定各個(gè)處理組蛋白灰度值，結(jié)果顯示灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5、TSA聯(lián)合Cisplatin對(duì)caspase-8及其前體表達(dá)的影響
　　TSA250nmol/L聯(lián)合Cisplatin10μg/mL處理細(xì)胞24h后，單藥處理組Pro-caspase-8表達(dá)減少，caspase-8蛋白表達(dá)增多，與對(duì)照組與單藥