原花青素和EGCG在Marc-145細(xì)胞中對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的抑制作用研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種以豬的呼吸道癥狀、新生仔豬的高死亡率以及母豬繁殖障礙為特征的傳染病，對全球范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。PRRS于1987年首次在美國被發(fā)現(xiàn)，我國于1996年分離出PRRSV毒株。在2006年，我國爆發(fā)了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征（HP-PRRS），并迅速傳播至東南亞，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，PRRS一直是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要病毒感染性疾病。目前防治P

2、RRS的主要手段是疫苗免疫，但是PRRSV的易變異性及疫苗的安全性導(dǎo)致疫苗接種預(yù)防的效果并不理想，而至今尚無被批準(zhǔn)的防治PRRS的藥物。因此，發(fā)展防控PRRS的新策略以及開發(fā)新型抗PRRSV藥物變得尤為緊迫。
　　我國傳統(tǒng)的中醫(yī)藥在病毒性疾病防治上發(fā)揮著重要的作用，從天然藥物中尋找抗PRRSV的藥物是一條重要途徑。原花青素（Procyanidin）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGC

3、G）均屬于茶多酚類化合物，具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理活性，其中以抗氧化活性被人們所熟知，目前已廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、保健品等領(lǐng)域。本文對原花青素和EGCG體外抗PRRSV的活性進(jìn)行了評價(jià)，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步研究。
　　本研究建立了PRRSV感染Marc-145細(xì)胞模型，運(yùn)用間接免疫熒光試驗(yàn)的方法，從11種茶多酚類化合物中篩選出2種對PRRSV具有顯著抗病毒活性的化合物—原花青素和EGCG，在此基礎(chǔ)上對兩種

4、藥物開展了系統(tǒng)的藥效評價(jià)。病毒的mRNA和蛋白的合成水平分別采用熒光定量PCR、Western blot等方法測定。測定了原花青素和EGCG在感染后48 h的抗PRRSV藥效，以及感染后48 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的藥效，還研究了藥物對PRRSV增殖的吸附、內(nèi)化、復(fù)制、釋放等不同階段的抑制效果，由此初步闡述原花青素和EGCG的抗PRRSV作用機(jī)制。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明，在感染后48 h，原花青素和EGCG在5~40μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈劑

5、量依賴性地顯著抑制PRRSV的增殖，并且40μg/mL的原花青素抑制效果優(yōu)于40μg/mL的利巴韋林。在感染后6~48 h內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)，40μg/mL的原花青素和EGCG均能有效抑制PRRSV的NSP9 mRNA和N蛋白的合成，在第48 h時(shí)抑制效果優(yōu)于40μg/mL的利巴韋林。原花青素和EGCG在5~40μg/mL的濃度范圍對PRRSV的吸附、內(nèi)化和釋放的過程有明顯的抑制效果，且呈劑量依賴性；而40μg/mL的原花青素和EGCG對P

6、RRSV的合成和組裝階段有顯著的抑制作用。將藥物與PRRSV直接作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5~40μg/mL的原花青素和EGCG均能使PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的能力下降，呈劑量依賴性；而藥物與Marc-145細(xì)胞的預(yù)作用，則無法阻止PRRSV感染細(xì)胞。
　　本文首次發(fā)現(xiàn)原花青素具有體外抗PRRSV作用，并探討了原花青素和EGCG體外抗PRRSV的作用機(jī)制是通過抑制PRRSV病毒粒子本身以及抑制PRRSV增殖的吸附、內(nèi)化、復(fù)制和釋放