TLRs和IFIT3在豬繁殖與呼吸綜合征病毒先天性免疫中的作用.pdf

1、近20年來，豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是目前危害世界養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán)重的病原之一，現(xiàn)有的商品化疫苗僅能提供部分保護(hù)力。宿主先天性免疫為抗病毒保護(hù)作用的第一道防線，并能介導(dǎo)獲得性免疫抵抗病毒感染。然而，有些病毒可以逃逸先天性免疫監(jiān)視造成持續(xù)感染從而可能導(dǎo)致病原流行。PRRSV可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生先天性免疫，但其機(jī)制尚不十分清楚。
　　本研究克隆獲得豬TLR2、3、7、8和9共5種Toll樣受體基因，建立了TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR

2、方法;豬體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PRRSV不同毒力毒株誘導(dǎo)的TLR2、3、7和8基因、TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-10細(xì)胞因子表達(dá)水平有較大差異;TLR3和TLR7/8配體能有效地提高PRRSV抗原豬體免疫保護(hù)效率;Poly(I∶C)通過IFIT3介導(dǎo)MAVS信號(hào)通路抑制PRRSV復(fù)制;成功構(gòu)建了TLR3啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白中Nsp1和Nsp4能顯著抑制豬TLR3啟動(dòng)子活性，從而為豐富了PRRSV免

3、疫機(jī)制理論基礎(chǔ)，為研究安全有效的新型疫苗提供了新的思路。
　　主要研究?jī)?nèi)容分為以下7個(gè)部分:
　　1.豬五種Toll樣受體基因克隆與序列分析
　　利用RT-PCR方法，從杜洛克×（長(zhǎng)白×黑豬）二元雜交豬的肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）中擴(kuò)增獲得豬TLR2、3、7、8和9基因，分別克隆至pMD18-T載體，基因測(cè)序結(jié)果為:豬TLR2、3、7、8和9基因長(zhǎng)度分別為2358bp、2718bp、3153bp、3087bp和3093b

4、p，分別編碼786、906、1051、1029和1031個(gè)氨基酸。同源性分析結(jié)果顯示，它們與GeneBank中豬TLR的相應(yīng)序列同源性達(dá)99％以上，與牛、馬、羊和人的同源性較高，與鼠的同源性次之，而與雞的同源性最低，為豬TLRs在PRRSV感染中的作用研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2.豬五種Toll樣受體TaqMan實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)方法的建立
　　根據(jù)GenBank中TLR2、3、7、8和9的基因序列，設(shè)計(jì)并合成各自特異性引物及

5、探針，以含TLRs基因的重組質(zhì)粒為模板，通過對(duì)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。并應(yīng)用該方法檢測(cè)PRRSV感染或poly(I∶C)刺激后PAMs中TLRsmRNA的相對(duì)水平。結(jié)果表明，TLRs基因的Ct值與陽(yáng)性質(zhì)粒濃度均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。該方法具有較高的靈敏性，檢測(cè)核酸分子DNA的下限為50copies/μL，組內(nèi)、組間變異系數(shù)保持在2.3％以內(nèi)。Poly(I∶C)刺激36h后，PAMs中TLR3

6、mRNA水平顯著升高;PRRSV感染36h后，PAMs中TLR2、3、7、8mRNA水平顯著升高。該方法的建立為豬TLRs的定量分析提供有有效工具。
　　3.PRRSV不同毒力毒株誘導(dǎo)Toll樣受體和細(xì)胞因子表達(dá)特性的比較
　　將24頭仔豬平均分成4組，每組6頭，分別接種高致病性PRRSV分離株BB0907(HP)，低毒力PRRSV毒株NT0801(LP)，NT0801第70代衍生毒株NT0801-F70(LP-der)和D

7、MEM營(yíng)養(yǎng)液（對(duì)照），隔離飼養(yǎng)觀察。攻毒后0、6、9、15天用ELISA方法檢測(cè)豬血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-10含量;攻毒后15天用Real-timePCR方法檢測(cè)各組肺臟和腦組織中TLR2、3、7和8基因表達(dá)水平，并分離豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAMs）和豬外周血淋巴細(xì)胞(PBMCs)，分別采用TLR2、3、7\8的配體(LTA、poly(I∶C)、CL097)和PRRSV刺激，檢測(cè)細(xì)胞上清中細(xì)胞因子水平。結(jié)果

8、為:與LP相比，HP組試驗(yàn)豬產(chǎn)生明顯臨床癥狀，而LP-der幾乎沒有毒力;HP感染豬的血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的水平高于LP或者LP-der組。LP組PAMs經(jīng)poly(I∶C)或CL097刺激后分泌的TNF-α和IL-1β水平顯著高于DMEM營(yíng)養(yǎng)液對(duì)照組，同時(shí)，HP組PBMCs經(jīng)CL097刺激后分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6顯著高于LP和LP-der組。HP組PBMCs經(jīng)CL097刺激后分泌的TNF-

9、α、IL-1β、IL-6高于LP和LP-der組，LP組PAMs經(jīng)poly(I∶C)、CL097刺激后TNF-α和IL-1β的分泌高于DMEM組。該結(jié)果表明，與LP和LP-der相比，HP更能誘導(dǎo)TLR3、7、8和TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ表達(dá)，從而豐富了PRRSV免疫和致病機(jī)制理論，并有助于開發(fā)更為有效的PRRSV疫苗。
　　4.豬Toll樣受體配體對(duì)PRRSV免疫佐劑作用
　　采用PRRSV滅活病毒液(

10、KV)與TLR配體組合后皮下免疫小鼠。結(jié)果表明，單獨(dú)的poly(I∶C)和CL097誘導(dǎo)小鼠IFN-γ和PRRSV特異性抗體水平高于KV組或KV-LTA組。進(jìn)而，將PRRSV滅活病毒液與poly(I∶C)或CL097混合后免疫仔豬，檢測(cè)其免疫保護(hù)效應(yīng)。結(jié)果為，KV混合poly(I∶C)或CL097后誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生的PRRSV特異性抗體和T淋巴細(xì)胞增殖水平高于KV組。攻毒后，與KV或?qū)φ战M相比，KV-poly(I∶C)或-CL097免疫組患

11、豬產(chǎn)生的臨床癥狀較輕、病毒血癥更低、肺部的病理?yè)p傷更少。表明KV-poly(I∶C)或-CL097能提高抵抗PRRSV的保護(hù)力。TLR3和TLR7/8的配體為新PRRSV疫苗的開發(fā)提供了候選佐劑。
　　5.豬IFIT3重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定
　　使用RT-PCR方法從豬肺泡巨噬細(xì)胞中擴(kuò)增出豬的IFIT3基因，成功構(gòu)建穿梭載體pShuttle-CMV-IFIT3，經(jīng)PCR、測(cè)序鑒定正確。將穿梭載體經(jīng)PmeⅠ線性化后，在大腸桿菌

12、BJ5183內(nèi)與腺病毒骨架載體pAdEasy-1進(jìn)行同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒基因組DNA。將重組腺病毒DNA經(jīng)PacⅠ酶切后線性化后通過脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)組裝成完整的腺病毒。通過RT-PCR、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)和Westem-blotting檢測(cè)到IFIT3的表達(dá)，證實(shí)重組腺病毒rAd-IFIT3可以正確表達(dá)目的蛋白，從而為下一步抗病毒試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
　　6.Poly(I∶C)通過IFIT3介導(dǎo)M

13、AVS信號(hào)通路抑制PRRSV復(fù)制
　　采用雙鏈RNA類似物poly(I∶C)作為刺激物，在MARC-145細(xì)胞上系統(tǒng)地觀察IFIT3在PRRSV復(fù)制過程中作用，結(jié)果顯示:雙鏈RNA類似物poly(I∶C)刺激MARC-145細(xì)胞可以抑制PRRSV復(fù)制，而IFIT3表達(dá)量明顯增加;過量表達(dá)豬IFIT3能顯著抑制PRRSV復(fù)制，干擾MARC-145細(xì)胞中內(nèi)源性IFIT3的表達(dá)，利于PRRSV增殖，且同時(shí)破壞了poly(I∶C)介導(dǎo)的抗

14、病毒功能;過量表達(dá)豬IFIT3可以顯著增加poly(I∶C)誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性，相反，干擾MARC-145細(xì)胞中內(nèi)源性IFIT3可以抑制poly(I∶C)誘導(dǎo)的IFN-β啟動(dòng)子活性;Poly(I∶C)能激活MARC-145細(xì)胞中IFIT3、TBK1和磷酸化IRF3的表達(dá)。此外，盡管poly(I∶C)刺激的MARC-145中IFIT3與PRRSV核衣殼(N)蛋白在細(xì)胞漿中存在共定位現(xiàn)象，但是共沉淀結(jié)果表明二者之間無相互作用。本研究

15、結(jié)果表明，poly(I∶C)通過IFIT3介導(dǎo)MAVS信號(hào)通路抑制PRRSV復(fù)制，從而為PRRSV新型疫苗和抗病毒藥物研究奠定了基礎(chǔ)。
　　7.PRRSV不同非結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)豬TLR3啟動(dòng)子活性影響
　　根據(jù)TLR3ORF基因序列設(shè)計(jì)兩條同向引物（GSP1和GSP2），利用4種限制性內(nèi)切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ分別消化從PAMs提取的基因組DNA，消化產(chǎn)物與適配子鏈接產(chǎn)生4種消化的DNA庫(kù)（DL1、DL2、DL

16、3和DLA），并分別以此為模板，進(jìn)行基因步移。用特異性引物GSP1與適配子引物AP1進(jìn)行第1步PCR擴(kuò)增，然后以第1步PCR產(chǎn)物為模板，用特異性引物GSP2與適配子引物AP2進(jìn)行第2步PCR擴(kuò)增。將獲得的特異性PCR產(chǎn)物克隆至pGL3-Basic質(zhì)粒，獲得pGL3-TLR3-Luc重組質(zhì)粒，基因序列測(cè)定結(jié)果證明該質(zhì)粒含有的外源基因與TLR3啟動(dòng)子基因序列一致。將pGL3-TLR3-Luc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞中經(jīng)poly(I∶C)