利用RNA干擾機制抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖.pdf

1、南京農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文利用RNA干擾機制抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖姓名：高曉飛申請學位級別：碩士專業(yè)：預防獸醫(yī)學指導教師：陳溥言20050601全文摘要利用RNA干擾機制抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖摘要利用PCR方法擴增出了PRRSVVR2332resP林的核衣殼蛋白基因(N基因)，并克隆迸熒光表達載體pEGFPN1中，利用卡那抗性篩選得到重組陽性克隆，經(jīng)雙酶切鑒定成功后，命名為pEGFPNI—ORF7。根據(jù)麻省理工學院和Amb

2、ion公司網(wǎng)站提供的RNAi靶位點選擇軟件，以及2004年Nature文獻，選定PRRSVVR2332resp株N基因兩處靶位點，并且提交NCBI的BLAST系統(tǒng)證明其與其它物種的低同源性后，設計合成六條單鏈，兩兩退火后克隆八RNA干擾載體pBS／U610中，利用氨芐抗性篩選，并經(jīng)缺失酶切位點Xhol鑒定，得到兩個干擾裁體pBS／U6—60和pBS／U6—260，以及一個對照載體pBS／U6Neg將真核表達熒光載體pEGFP—NIORF

3、7分別與pBS／U6—60，pBS／U6—260以及對照裁體pBS／U6一COntrei共轉(zhuǎn)染入293T細胞中，16小時后檢測，通過GFP表達數(shù)量以及用Western—blot鑒定GFP具體表達量的對比，觀察到pBS／U6—60，pBS／U6—260對pEGFP—N卜ORF7的表達有明顯的抑制作用，并用RT—PCR確定表達產(chǎn)物為目的產(chǎn)物，證明本實驗中干擾載體的高度特異性。定量分析Western—blot條帶，結(jié)果表明pBS／U660，p

4、BS／U6260對N基因的干擾效果分別為8290％和6995％。根據(jù)實驗結(jié)果可以看出，RNAi可以對PRRSVN基因的表達產(chǎn)生干擾作用，提出所選取的靶位點可能是兩個對PRRSV全病毒復制起抑制作用的潛在位點。轉(zhuǎn)染pEGFPNI熒光載體進入MARC145細胞系，摸索真核表達載體在MARC145細胞中高效表達的奈件，為RNA干擾栽體在MARC一145細胞中成功執(zhí)行生物學功能做鋪墊。設定不同的PRRSV病毒接毒量和不同的接毒時間，將干擾載體p

5、BS／U6—60和pBS／U6—260以及對照載體pBS／U6一tteg轉(zhuǎn)染進入宿主細胞MARC145中，成功檢測到pBS／U6—60和pBS／U6—260在MARC一145細胞中對PRRSV病毒增殖的抑制現(xiàn)象。選取轉(zhuǎn)染前后不同時間段的病毒上清做病毒TCID50測定，觀察CPE并利用IFA檢測，得到pBS／U660和pBS／U6—260抑制PRRSVVR2332resP株增殖作用的動態(tài)數(shù)據(jù)，顯示RNA干擾技術(shù)可以在72到120小時顯著抑

6、制PRRsv的繁殖，在預防和治療上都有顯著效果。選取接毒后72小時，對病毒中N基因的表達情況進行Western—blot鑒定，結(jié)果顯示，pBS／D660干擾FRRSVVR2332Resl3株N基因表達的效率可以達到7015％。最終，(I)證實在真核細胞水平上，可以利用RNA干擾機制抑制PRRSVVR2332resp株的增殖；(】1)提出在所選PRRSVVR2332resP株N基因的兩處靶位點序列中，存在病毒復制的關鍵性作用位點的觀點：(