豬繁殖與呼吸綜合征病毒nsp4切割ZAP的機(jī)制研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）主要引起母豬繁殖障礙，公豬精液質(zhì)量下降，以及仔豬呼吸系統(tǒng)疾病，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）。PRRSV屬于動(dòng)脈炎病毒科，為單股正鏈、有囊膜的RNA病毒，基因組長(zhǎng)度約

2、為15kb。
　　在與病毒長(zhǎng)期共存的過程中，宿主進(jìn)化出一些抗病毒基因，這些抗病毒基因編碼的蛋白，即宿主限制因子，可以抑制病毒的增殖。鋅指抗病毒蛋白(Zinc finger antiviral protein，ZAP)是一種重要的宿主限制因子，存在兩種剪接變異體(ZAP-L和ZAP-S)。以前的研究證實(shí)ZAP的兩種剪接變異體對(duì)多種病毒具有抑制作用。目前，對(duì)豬源ZAP的研究較少，其能否抑制PRRSV的增殖也未見報(bào)道。鑒于此，本論文以P

3、RRSV、豬源ZAP和PRRSV nsp4作為研究對(duì)象，探究ZAP是否能夠抑制PRRSV的增殖及其抗病毒機(jī)制，同時(shí)探究PRRSV是否存在拮抗ZAP抗病毒作用的機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.超表達(dá)ZAP抑制PRRSV的增殖
　　克隆了豬源ZAP兩種剪切變異體（ZAP-L和ZAP-S）的全長(zhǎng)cDNA，并構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒Flag-ZAP-L和Flag-ZAP-S。將其分別轉(zhuǎn)染MARC-145細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后接種0.5MOI

4、的PRRSV，在PRRSV感染24h后收樣，通過Real-time PCR、TCID50、IFA以及Western blot檢測(cè)超表達(dá)ZAP對(duì)PRRSV增殖的影響，結(jié)果表明超表達(dá)ZAP-L和ZAP-S均顯著抑制PRRSV的增殖，并呈劑量依賴性。
　　2.ZAP不靶向PRRSV的5'UTR和3'UTR
　　以前的研究報(bào)道ZAP可以通過靶向病毒的5'UTR和3'UTR從RNA水平上抑制辛德畢斯病毒等病毒的增殖。為了探究ZAP是否

5、靶向PRRSV的5'UTR和3'UTR，分別將PRRSV的5'UTR和3'UTR克隆到pGL3control載體上，然后將Flag-ZAP-L和Flag-ZAP-S以及空載體pCAGGS-Flag分別與pGL3control-PRRSV-5'UTR或pGL3control-PRRSV-3'UTR以及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果表明ZAP不靶向PRRSV的5'UTR和3'UTR。
　　3.Z

6、AP-L抑制PRRSV nsp7β，nsp9，nsp12的表達(dá)，而PRRSV nsp4能夠切割ZAP
　　以前的研究報(bào)道ZAP-L還可以通過降解病毒的蛋白抑制流感病毒等病毒的增殖，為了探究ZAP-L能否通過同樣的方式抑制PRRSV的增殖，將PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒和Flag-ZAP-L共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ZAP-L呈劑量依賴性抑制PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白nsp7β，nsp9和nsp12

7、的表達(dá)。同時(shí)我們還意外地發(fā)現(xiàn)PRRSV nsp4能夠切割ZAP，并且PRRSV nsp4對(duì)ZAP的切割也呈劑量依賴性。
　　4.PRRSV nsp4對(duì)ZAP的切割依賴其3C樣絲氨酸蛋白酶活性
　　由于PRRSV nsp4是一種典型的3C樣絲氨酸蛋白酶，具有切割活性，為了說明nsp4對(duì)ZAP的切割是否依賴其3C樣蛋白酶活性，通過定點(diǎn)突變構(gòu)建了其酶活突變體真核表達(dá)質(zhì)粒(H39A，D64A，S118A)，將Flag-ZAP-L分別

8、與PRRSV nsp4野生型及酶活突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PRRSVnsp4的酶活突變體不能切割ZAP，而野生型的nsp4可以切割ZAP，說明nsp4對(duì)ZAP的切割依賴其3C樣絲氨酸蛋白酶活性。進(jìn)一步利用泛素-蛋白酶體途徑、細(xì)胞自噬溶酶體途徑和細(xì)胞凋亡途徑的抑制劑檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PRRSV nsp4切割ZAP不依賴細(xì)胞自噬、凋亡及蛋白酶體途徑。
　　5.PRRSV nsp4識(shí)別ZA

9、P第411位谷氨酸，且切割ZAP產(chǎn)生片段的抗病毒作用顯著減弱
　　根據(jù)PRRSV nsp4識(shí)別底物P1位氨基酸的特點(diǎn)及其切割ZAP產(chǎn)生片段的大小，推測(cè)其切割ZAP的潛在位點(diǎn)有六個(gè):E288，E329A，E334A，E371A，E411A，E453A。為了確定PRRSV nsp4切割ZAP的位點(diǎn)，通過定點(diǎn)突變構(gòu)建了ZAP-L突變體的真核表達(dá)質(zhì)粒(E288A，E329A，E334A，E371A，E411A，E453A)，將其與野生型Z

10、AP-L的真核表達(dá)質(zhì)粒分別與PRRSV nsp4的真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)除了突變體E411不被切割外，其他幾個(gè)突變體和野生型ZAP-L均被切割，說明PRRSV nsp4識(shí)別ZAP第411位谷氨酸。為了進(jìn)一步探討PRRSV nsp4切割ZAP的生物學(xué)意義，構(gòu)建了ZAP-L被切割后產(chǎn)生的片段ZAP(1-411)和L(412-895)以及ZAP-S被切割后產(chǎn)生的C端片段S(412-779)的真