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文檔簡介
1、PRRSV是正鏈帶囊膜的RNA病毒,PRRSV感染先與易感細(xì)胞表面硫酸乙酞肝素結(jié)合發(fā)生吸附,隨后與唾液酸粘附素的結(jié)合引發(fā)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞形成內(nèi)體小泡。內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞后PRRSV需要解聚將其基因組釋放并進(jìn)入細(xì)胞漿才能產(chǎn)生感染性病毒粒子。在此過程中除了清道夫受體CD163和pH的降低等因素外,一些蛋白酶活性的分子也是PRRSV感染侵入所必須的。然而相對(duì)于PRRSV的吸附內(nèi)吞過程,PRRSV借助何種膜泡運(yùn)輸機(jī)制最終突破囊膜屏障釋放其基因
2、組進(jìn)入細(xì)胞漿還一無所知。目前大多數(shù)病毒,包括PRRSV,在感染宿主細(xì)胞的過程中是通過特異性的吸附在細(xì)胞表面而被細(xì)胞以“主動(dòng)胞飲”的方式內(nèi)吞,然后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)主要分選站早期內(nèi)含體,之后走向經(jīng)典的內(nèi)吞-溶酶體途徑,或循環(huán)內(nèi)含體膜泡轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。然而許多病毒在進(jìn)入內(nèi)吞-溶酶體死亡途徑前在內(nèi)膜系統(tǒng)中pH、離子濃度等因素作用下引發(fā)病毒穿刺進(jìn)入細(xì)胞漿產(chǎn)生感染性病毒粒子。
Rab蛋白是介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膜泡運(yùn)輸?shù)木哂蠫TP酶活性的開關(guān)分子,同時(shí)也是作
3、為各內(nèi)含體膜泡的標(biāo)志性蛋白,已廣泛用于定位細(xì)胞內(nèi)各種內(nèi)含體膜泡的研究,如Rab5定位早期內(nèi)含體、Rab7定位晚期內(nèi)含體、Rab11定位近核循環(huán)內(nèi)含體。因此我們以Rab蛋白與PRRSV的共定位實(shí)驗(yàn)結(jié)合Rab蛋白負(fù)調(diào)控突變體對(duì)PRRSV感染的抑制試驗(yàn)確定PRRSV內(nèi)吞后膜泡運(yùn)輸途徑,DsRED-Rab5/7/11與PRRSV的共定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PRRSV能與Rab5/7共定位,另外Rab5/7蛋白負(fù)調(diào)控突變體實(shí)驗(yàn)也顯示Rab5/7負(fù)調(diào)控突變
4、體能明顯抑制PRRSV感染,抑制效果分別為70%、30%-80%,因此PRRSV感染依賴于早期內(nèi)含體和晚期內(nèi)含體的膜泡運(yùn)輸,而近核循環(huán)內(nèi)含體膜泡運(yùn)輸與PRRSV感染無關(guān)。
另外與囊泡運(yùn)輸相關(guān)的PI3K途徑(磷脂酰肌醇激酶途徑),通過與Rab5互作共同調(diào)節(jié)早期內(nèi)含體的膜泡運(yùn)輸與融合,為了更好的解析PRRSV感染過程中的早期內(nèi)含體膜泡運(yùn)輸過程,我們以PI3K的抑制劑LY294002干擾細(xì)胞早期內(nèi)含體膜泡運(yùn)輸過程來確定其在PRR
5、SV感染中的作用,結(jié)果表明LY294002對(duì)PRRSV在Marc-145中的感染無明顯抑制作用,因此PRRSV的感染可能通過不依賴于PI3K的非經(jīng)典早期內(nèi)含體膜泡運(yùn)輸途徑介導(dǎo)。
PKC是另一與囊泡運(yùn)輸相關(guān)的信號(hào)分子,與Rab11共同調(diào)節(jié)近核循環(huán)內(nèi)含體的運(yùn)輸。同樣為了更好的解析PRRSV感染與近核循環(huán)內(nèi)含體膜泡運(yùn)輸?shù)年P(guān)系,我們以PKC的抑制劑bisindolylmaleimide(BIM)I干擾細(xì)胞近核循環(huán)內(nèi)含體膜泡運(yùn)輸過程
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