豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起MARC-145細胞產(chǎn)生自噬對病毒復(fù)制的影響及其信號通路研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起以妊娠母豬繁殖障礙以及仔豬和生長育肥豬呼吸道癥狀和高死亡率為特征的豬繁殖與呼吸綜合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。盡管對PRRSV致病機制進行了廣泛的研究，取得了一系列有重要意義的成果，但在病毒的感染機制

2、及與宿主細胞的相互作用機制等方面，人們還知之甚少，是近年來的研究熱點。本研究主要針對PRRSV感染后誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生自噬反應(yīng)的分子機制進行了深入探討，系統(tǒng)分析了PRRSV與細胞自噬的相互作用機制。主要研究內(nèi)容包括:
　　1.PRRSV感染引起MARC-145細胞產(chǎn)生自噬現(xiàn)象
　　應(yīng)用透射電子顯微技術(shù)、共聚焦免疫熒光技術(shù)，免疫印跡(WesternBlot)分析，對感染PRRSV的細胞的自噬水平進行定性和定量分析。透射電鏡可以觀察到

3、感染PRRSV的細胞胞漿近核區(qū)雙膜自噬體樣結(jié)構(gòu)顯著增多;感染PRRSV的細胞內(nèi)LC3呈點狀分布，且與PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2共定位，表明自噬可能參與到PRRSV的復(fù)制;WesternBlot檢測到細胞內(nèi)LC3-Ⅱ分子的水平隨著病毒復(fù)制不斷增加;結(jié)果表明，PRRSV感染可以誘導(dǎo)MARC-145細胞產(chǎn)生自噬。而紫外線UV滅活的病毒不能引起細胞自噬的活化。這些結(jié)果表明，PRRSV的感染復(fù)制與細胞自噬密切相關(guān)。
　　2.細胞自噬影響P

4、RRSV的復(fù)制
　　我們通過自噬藥物調(diào)節(jié)劑及shRNAs干擾技術(shù)，改變MARC-145細胞的自噬活性，再感染PRRSV，測定PRRSV滴度，檢測分析細胞自噬對病毒復(fù)制的影響。結(jié)果表明，自噬誘導(dǎo)劑rapamycin可以提高MARC-145細胞自噬水平，細胞內(nèi)N蛋白的表達量及細胞上清子代病毒的滴度明顯增加;相反，利用自噬抑制劑3-MA降低細胞自噬水平后，MARC-145細胞內(nèi)病毒N蛋白的表達量及細胞上清子代病毒的滴度顯著降低。同樣，干

5、擾自噬基因ATG5和LC3B抑制細胞自噬，細胞內(nèi)病毒N蛋白的表達量及細胞上清子代病毒量顯著降低。這些結(jié)果表明細胞自噬可以促進PRRSV在MARC-145細胞的復(fù)制。我們利用流式細胞術(shù)檢測了高濃度藥物rapamycin(500nM)和3-MA(20mM)處理對PRRSV入胞的影響，并檢測了藥物處理細胞及自噬基因缺失細胞其上清乳酸脫氫酶LDH含量變化以檢測藥物及干擾處理的細胞毒性。結(jié)果表明，自噬調(diào)節(jié)藥物并不影響細胞的病毒的入胞;自噬調(diào)節(jié)藥物

6、處理細胞及自噬基因缺失細胞其上清乳酸脫氫酶LDH含量與對照組細胞沒有明顯變化，表明該處理影響病毒復(fù)制并不是通過其細胞毒性及影響病毒入胞。
　　3.細胞自噬為豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制提供位點
　　確定細胞自噬可以促進病毒復(fù)制的基礎(chǔ)上，我們進一步研究了PRRSV引起的自噬體特性，研究發(fā)現(xiàn)在PRRSV誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬體，其標志分子LC3不能完全與溶酶體的標志分子LAMP1及染料Lysotracker特異性標記的溶酶體結(jié)構(gòu)共定位;通

7、過轉(zhuǎn)染雙熒光質(zhì)粒GFP-RFP-LC3，在PRRSV感染的細胞內(nèi)雙陽性的GFP和RFP蛋白可以共定位，而在沒有感染PRRSV的細胞內(nèi)則主要為紅色RFP-LC3蛋白為主;溶酶體抑制藥物CQ也沒有進一步的改變?nèi)苊阁w對LC3-Ⅱ蛋白的降解，所有這些結(jié)果表明，PRRSV引起的自噬體與溶酶體的融合受到抑制。病毒蛋白NSP2及dsRNA能夠與自噬體標志分子LC3-Ⅱ共定位，說明PRRSV復(fù)制復(fù)合體可能利用了自噬體結(jié)構(gòu);通過密度梯度離心初步分離純化病

8、毒復(fù)制復(fù)合體并進行westernblot驗證了PRRSV復(fù)制成分與自噬體標志分子LC3-Ⅱ及ER標志分子PDI的共密度梯度組分，結(jié)果表明，PRRSV感染抑制了自噬體與溶酶體的融合，從而利用自噬體結(jié)構(gòu)作為自身復(fù)制的膜結(jié)構(gòu)，促進了病毒的增殖。
　　4.豬繁殖與呼吸綜合征病毒通過mTOR通路影響自噬
　　自噬體的誘導(dǎo)具有嚴格的細胞信號通路調(diào)控，在本研究中我們首先檢測了在自噬中具有重要調(diào)節(jié)作用的激酶的變化并通過藥物特異性抑制信號通路

9、中各個激酶活性，研究其在PRRSV感染誘導(dǎo)的MARC-145細胞自噬中所起的作用。結(jié)果表明，在PRRSV感染的MARC-145細胞中，mTORC1活性受到抑制導(dǎo)致自噬活化增強，mTOR下游信號通路蛋白P70S6K和4E-BP1的磷酸化水平降低進一步驗證了mTORC1活性受到抑制;mTOR上游激酶PI3K抑制劑LY294002和rapamycin可以抑制mTOR的磷酸化而增強細胞的自噬水平進一步表明mTOR在PRRSV誘導(dǎo)引起的自噬中的作

10、用。AMPK在PRRSV感染后磷酸化水平增加，通過抑制劑CompoundC抑制酶活后，自噬水平?jīng)]有受到影響，說明雖然AMPK磷酸化水平的增加在PRRSV誘導(dǎo)引起的自噬中可能不起作用。
　　5.UPR與自噬的關(guān)系研究
　　病毒感染引起的UPR在自噬的誘導(dǎo)發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。在本研究中，我們檢測比較了在PRRSV感染的MARC-145細胞和ERstress誘導(dǎo)劑衣霉素TU處理細胞內(nèi)UPR信號通路PERK、eIF2α及JNK的

11、磷酸化水平及XBP1的剪切，結(jié)果顯示，PRRSV感染分別在4hpi和6hpi引起了PERK通路PERK及其下游eIF2α磷酸化增強，與PRRSV誘導(dǎo)引起的自噬趨勢一致;XBP1的剪切水平在8hpi開始出現(xiàn)，JNK的磷酸化水平也顯著增加;這些結(jié)果表明，PRRSV可以引起MARC-145細胞內(nèi)IRE1α/XBP1和PERK兩條UPR信號通路的活化。通過對IRE1α基因進行干擾敲除，我們分析了UPR在PRRSV誘導(dǎo)引起的自噬中的作用，結(jié)果表明