豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染Marc-145細(xì)胞激活白細(xì)胞介素8的表達(dá)的研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種以妊娠母豬嚴(yán)重繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病。PRRS自1987年首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)于美國以來，現(xiàn)已遍及世界各主要養(yǎng)豬國家與地區(qū)，并已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。2006年夏季我國南方諸省暴發(fā)“豬無名高熱病”，損失嚴(yán)重，持續(xù)流行，造成全國十幾個(gè)省發(fā)生疫情，其中PRRSV是最主要病原。
　　 細(xì)胞因子在病毒免疫和致病方面的作用非常

2、重要。IL－8是1987年Yoshimur發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)趨化性細(xì)胞因子，屬于C-X-C趨化因子超家族中的一個(gè)成員。IL－8屬于調(diào)節(jié)炎癥的介質(zhì)，對細(xì)菌和病毒感染引發(fā)的炎癥和免疫過程有重要的調(diào)節(jié)作用。已有試驗(yàn)證明豬感染PRRSV后能誘導(dǎo)體內(nèi)IL－8的產(chǎn)生，但PRRSV誘導(dǎo)IL－8機(jī)制并不清楚。鑒于此，開展了PRRSV感染Marc-145細(xì)胞誘導(dǎo)IL-8產(chǎn)生的機(jī)制的研究，主要內(nèi)容包括：
　　 1．PRRSV感染Marc-145細(xì)胞激活I(lǐng)

3、L-8。
　　 將由白細(xì)胞介素8（IL-8）全長啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒plL-8-luc與熒光內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，24h接種PRRSV CH-1a株，經(jīng)熒光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)PRRSV感染后3h內(nèi)能顯著激活I(lǐng)L-8，感染后6h激活倍數(shù)更高，之后逐漸降低。由此PRRSV感染Marc-145細(xì)胞以后可以激活I(lǐng)L-8，且感染后6h激活倍數(shù)最高。
　　 2．PRRSV N蛋白和Nsp2蛋白在Marc

4、-145細(xì)胞中表達(dá)能激活I(lǐng)L-8。
　　 為了確定PRRSV的哪種編碼蛋白參與了誘導(dǎo)IL-8，將編碼PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒分別與pIL-8-luc及pRL-TK共轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，36h后檢測熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)蛋白N和非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2能激活I(lǐng)L-8，而其他編碼蛋白則無明顯的激活作用。
　　 3．PRRSVN蛋白和Nsp2蛋白激活I(lǐng)L-8的必需區(qū)域。
　　 N蛋白和Nsp2蛋白在

5、Marc-145細(xì)胞中的表達(dá)能激活I(lǐng)L-8。為了確定N蛋白和Nsp2蛋白誘導(dǎo)IL-8產(chǎn)生的確切結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了N蛋白和Nsp2蛋白的缺失突變體真核表達(dá)質(zhì)粒。利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測，發(fā)現(xiàn)N蛋白發(fā)揮作用的主要是其30～73位氨基酸區(qū)域，該區(qū)域包含了N蛋白的NLS區(qū)域、NoLS區(qū)域和RNA結(jié)合區(qū)：但沒有發(fā)現(xiàn)Nsp2蛋白激活I(lǐng)L-8的特定區(qū)域。
　　 4．PRRSV感染Marc-145細(xì)胞激活I(lǐng)L-8信號通路的研究。
　　 為了

6、解PRRSV感染Marc-145細(xì)胞誘導(dǎo)IL-8產(chǎn)生的信號通路，將由IL-8全長啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pIL-8-luc、由IL-8編碼區(qū)上游133bp的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒-133bp-luc、以及在-133bp-luc基礎(chǔ)上分別在NF-κB、AP-1和NF-IL-6轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)突變的突變體NF-κBmut-luc、AP-lmut-luc、NF-IL-6mut-luc分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK轉(zhuǎn)染Marc-1

7、45細(xì)胞，24h 后接種PRRSV CH-1a株，接毒后6h檢測熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)NF-κBmut-luc、 NF-IL-6mut-luc轉(zhuǎn)染組感染PRRSV后IL-8沒有明顯激活，而plL-8-luc-133bp-luc及AP-lmut-luc轉(zhuǎn)染組感染PRRSV后均可以明顯激活I(lǐng)L-8啟動(dòng)子活性，即NF-κB及NF-IL-6兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變后不能誘導(dǎo)IL-8的表達(dá)，說明NF-κB及NF-IL-6兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子對于PRRSV激活