CD169、CD163和3’非翻譯區(qū)人工微小RNA對豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染豬肺巨噬細胞的抑制作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是我國養(yǎng)豬業(yè)中重要的傳染病之一，造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前防控PRRS的主要手段為疫苗接種，但保護效果欠佳，且活疫苗存在安全隱患。RNA干擾是一種真核細胞固有的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制，也是先天性抗病毒機制，目前已發(fā)展成為有效的抗病毒感染策略。據(jù)報導(dǎo)，基因工程載體表達的人工微小RNA（artificial miRNA，am

2、iRNA）能夠作為有效的抗病毒手段，而人和小鼠的外排體(exosome)可以作為微小RNA的傳遞載體。
　　PRRSV主要感染豬的單核-巨噬細胞系統(tǒng)，特別是豬肺巨噬細胞(porcine alveolarmacrophage，PAM)。參與PAM感染的受體主要有CD163和唾液酸粘附素(sialoadhesin，Sn)或稱CD169，前者是起主要作用的核心受體，后者是起次要作用的輔助受體。PRRSV基因組5'和3'非翻譯區(qū)(untr

3、anslated region，UTR)含有高度保守的順式調(diào)控序列，在病毒復(fù)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了研究控制PRRS的新策略，本研究構(gòu)建了表達CD163、Sn和3'UTR amiRNA的重組腺病毒(recombinant adenovirus，tAd)，并在細胞水平上研究rAd和外排體傳導(dǎo)的amiRNA對PRRSV感染或復(fù)制的抑制作用。
　　為了研究CD163和Sn特異amiRNA對PRRSV感染的抑制作用，分別將兩個amiRNA表

4、達盒插入腺病毒載體，用重組載體轉(zhuǎn)染AAV-293細胞，獲得了兩株rAd。流式細胞術(shù)和熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，rAd能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)PK-15細胞，感染指數(shù)(MOI)為100時的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率可達100％;原代PAM細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率很低，MOI為800時的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率僅達62％。Real-time RT-PCR檢測結(jié)果顯示，rAd轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞不僅能有效表達序列特異amiRNA，而且表達的amiRNA能通過外排體分泌到細胞外。Real-time RT-PCR和流

5、式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，rAd表達和外排體傳送的amiRNA均能顯著抑制CD163和Sn基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達，兩種方式同時傳遞amiRNA的抑制作用更強。Real-time RT-PCR和病毒滴定結(jié)果顯示，兩種rAd轉(zhuǎn)導(dǎo)和含兩種amiRNA外排體孵育PAM細胞可顯著降低PRRSV ORF7拷貝數(shù)和病毒滴度，抑制作用可持續(xù)96小時，對3株不同毒力PRRSV感染具有相同的抑制效果。這些研究資料表明，rAd是有效的amiRNA表達載體，豬細胞源外

6、排體可作為amiRNA的傳送載體，兩種方式共同傳送的CD163和Sn特異amiRNA對抑制PRRSV感染PAM細胞具有相加作用。
　　為了研究不同細胞源外排體向PAM細胞傳送amiRNA的效率，將PRRSV3'UTR特異amiRNA表達盒插入腺病毒載體，用重組載體轉(zhuǎn)染AAV-293細胞，用獲得的rAd分別轉(zhuǎn)導(dǎo)豬腎細胞系PK-15、豬肺巨噬細胞系3D4/163、原代豬腎成纖維細胞PFC和子宮內(nèi)皮細胞PEEC，從轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞培養(yǎng)液分離外排

7、體。Real-time RT-PCR檢測結(jié)果顯示，rAd轉(zhuǎn)導(dǎo)的4種豬源細胞不僅能有效表達序列特異amiRNA，而且表達的amiRNA能通過外排體分泌到細胞外，但不同細胞分泌amiRNA的能力有所差異。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，熒光染料標(biāo)記的外排體能被上述4種類型細胞和原代PAM細胞有效攝取。Real-timeRT-PCR檢測結(jié)果顯示，原代PAM細胞能有效攝取4種細胞源外排體及其amiRNA，并具有時間和劑量依賴性。Real-time RT