粘附素及其他致病相關(guān)因子在中間普氏菌與人上皮細(xì)胞互作中的作用研究.pdf

1、牙周病是常見的口腔疾病,在世界范圍內(nèi)有很高的發(fā)病率。中間普氏菌(Prevotella intermedia)是一種與牙周病相關(guān)的病原菌,在牙周病的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的作用。中間普氏菌能粘附和侵入多種宿主細(xì)胞,在這一過程中細(xì)菌粘附素及其他致病相關(guān)因子起了很重要的作用。目前該過程的分子機(jī)制以及所參與蛋白的功能仍有待進(jìn)一步的研究。本論文利用中間普氏菌17全基因組序列,應(yīng)用生物信息學(xué)、基因組學(xué)和蛋白組學(xué)方法來研究中間普氏菌與人上皮細(xì)胞相互作用

2、過程中相關(guān)基因和蛋白的功能及其機(jī)制。
　　 生物信息學(xué)研究中間普氏菌全基因組序列發(fā)現(xiàn)其具有兩個富含亮氨酸重復(fù)序列的潛在粘附素,AdpD和AdpE。分別把編碼這兩個蛋白的基因PI1564和PI1571克隆到pET30a(+)原核表達(dá)載體上,并將重組的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中誘導(dǎo)AdpD和AdpE融合蛋白的表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)分析表明AdpD特異結(jié)合纖維蛋白原,而AdpE特異結(jié)合膠原蛋白。We

3、stern印跡表明AdpD和AdpE分布在中間普氏菌細(xì)胞外膜上。額外加入的融合蛋白AdpD和AdpE能抑制中間普氏菌粘附到口腔上皮細(xì)胞HN4。這些結(jié)果表明,AdpD和AdpE可能在中間普氏菌粘附到口腔上皮細(xì)胞的過程中起到一定的作用。
　　 運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)來檢測中間普氏菌粘附素及其他致病相關(guān)因子在中間普氏菌與HeLa細(xì)胞相互作用后的基因表達(dá)情況。并成功運(yùn)用自己設(shè)計(jì)的qRT-PCR陣列,采用相對定量的方

4、法檢測172個中間普氏菌基因在HeLa細(xì)胞環(huán)境中的表達(dá)情況。當(dāng)中間普氏菌與HeLa細(xì)胞相互作用24 h后中間普氏菌基因表達(dá)水平發(fā)生明顯變化,其中31個基因的表達(dá)變化在2倍以上。與此不同的是,與常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基相比,中間普氏菌在HeLa細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后的基因表達(dá)比較穩(wěn)定,只有2個基因在HeLa細(xì)胞條件培養(yǎng)液中表達(dá)下降。在中間普氏菌與HeLa細(xì)胞相互作用后表達(dá)顯著上升的基因中挑選基因PI0137做進(jìn)一步的生物學(xué)功能分析。其原因是基

5、因PI0137在這個過程中表達(dá)顯著上升了3.1倍,而且生物信息學(xué)分析顯示PI0137編碼的蛋白可能是一個具有粘附作用的凝集素樣蛋白前體。因此基因Pi0137被分子克隆并在大腸桿菌中原核表達(dá)其編碼的蛋白。ELISA結(jié)果表明PI0137編碼的蛋白特異結(jié)合凝集素。這些研究表明qRT-PCR列陣是一種快速有效篩選互作基因的方法。
　　 通過研究中間普氏菌生長在分泌有細(xì)胞因子的上皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液中的蛋白和基因表達(dá)水平來分析中間普氏菌在宿主

6、體內(nèi)環(huán)境中的生長情況。準(zhǔn)備了三種中間普氏菌生長的培養(yǎng)液分別為上皮細(xì)胞HN4和HeLa細(xì)胞培養(yǎng)了24 h后收集的細(xì)胞條件培養(yǎng)液,以及常規(guī)培養(yǎng)HN4和HeLa的細(xì)胞培養(yǎng)基,并應(yīng)用二維凝膠電泳(2-DE)結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)技術(shù)分析中間普氏菌在這三種不同培養(yǎng)液中的蛋白表達(dá)水平。中間普氏菌全蛋白以及外膜蛋白在三種不同培養(yǎng)液下的2-DE圖譜總體上比較相似,有一些蛋白在HN4和HeLa條件培養(yǎng)液中發(fā)生了顯著的變化。用質(zhì)譜分析了