眼畸形轉(zhuǎn)錄因子在人視網(wǎng)膜色素上皮細胞中的功能研究.pdf

1、目的:探討眼畸形轉(zhuǎn)錄因子(MITF)在人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigmentepithelium)色素化與功能及其作用機制。
　　 方法:首先通過PCR獲得人MITF基因M-亞型的全長編碼區(qū),將這種MITF亞型克隆到pBABE-HA-ER載體上。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到病毒包裝細胞PT67,產(chǎn)生相應(yīng)病毒。通過病毒感染,將這種亞型的基因?qū)氲饺艘暰W(wǎng)膜色素上皮細胞系(ARPE-19)。其次利用誘導(dǎo)性表達的實驗系統(tǒng)(T

2、amoxifen-inducible system),以控制MITF-M的蛋白進入細胞核或阻滯于細胞質(zhì)中。最后通過Real-time-PCR,RT-PCR,Western blotting,免疫熒光等不同技術(shù)從多個水平和角度檢測ARPE-19細胞在外源性的表達MITF的條件下,其形態(tài)學(xué),細胞色素化與RPE特異性基因的變化情況。
　　 結(jié)果:實驗結(jié)果顯示,通過RT-PCR和western blotting可以檢測到MITF在ARP

3、E-19細胞中表達,但通過免疫熒光則不能檢測MITF的表達。結(jié)果還顯示,感染HA-ER-MITF-M載體,并經(jīng)過4-OHT誘導(dǎo)后的ARPE-19細胞,其Ki67表達量及陽性數(shù)上升。結(jié)果進一步顯示,轉(zhuǎn)染HA-ER-MITF-M的ARPE-19細胞與感染HA-ER-MITF-M的ARPE-19細胞,并經(jīng)過4-OHT誘導(dǎo),其Tyrosinase(Tyr),Tyrosinase-related protein1(Tyrp1),Orthodent