鈣超載在培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞脂褐素形成中的作用.pdf

1、研究背景和目的：視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE) 細(xì)胞不斷吞噬光感受器外節(jié)(photo receptor segment, POS) 末端脫落的膜盤(pán)而形成脂褐素(lipofuscin, LPF)。脂褐素的大量沉積可造成RPE 細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的改變，從而導(dǎo)致AMD、Stargard 病等眼部疾病。鈣離子是細(xì)胞一切生命活動(dòng)重要的第二信使，但病理情況下大量的鈣離子內(nèi)流引發(fā)鈣超載可造成細(xì)胞的損傷及

2、凋亡。有研究表明，鈣超載是一切細(xì)胞死亡的最后通路。鹽酸氟桂利嗪(flunarizine, FNZ) 是第四代高選擇性的鈣離子通道拮抗劑，可以阻滯過(guò)量的鈣離子內(nèi)流，從而穩(wěn)定細(xì)胞膜，減少氧自由基的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞。鹽酸甲氯酚酯(centrophenoxine, CPH) 是一種臨床使用多年的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，具有清除細(xì)胞內(nèi)脂褐素及氧自由基、保護(hù)細(xì)胞膜等作用。 本實(shí)驗(yàn)旨在觀察培養(yǎng)人RPE 細(xì)胞和牛POS 共培養(yǎng)建立RPE 細(xì)胞脂褐素形

3、成的模型中，鈣超載在RPE 細(xì)胞脂褐素形成過(guò)程中的作用及FNZ、CPH 對(duì)其的抑制作用及對(duì)RPE 細(xì)胞活力的影響。 方法： (1) 將培養(yǎng)人RPE細(xì)胞與制備的2×1010 /L牛POS共培養(yǎng)，建立脂褐素形成模型。用鈣熒光指示劑Fluo-3/AM、激光掃描共聚焦顯微鏡(laserscanning confocal microscope，LSCM) 及流式細(xì)胞儀(flow cytometry, FCM)觀察培養(yǎng)12 h，1、

4、2、4 和8 d時(shí)間點(diǎn)胞內(nèi)鈣離子的變化；用MTT比色法及嗜銀蛋白染色分析法觀察培養(yǎng)12 h，1、2、4 和8 d的細(xì)胞活力。 (2) 用Fluo-3/AM、LSCM 及FCM 觀察不同濃度鹽酸氟桂利嗪對(duì)培養(yǎng)人RPE 細(xì)胞和牛POS 共培養(yǎng)脂褐素生成模型中12 h，1、2、4 和8 d 胞內(nèi)鈣離子變化的影響；用MTT 比色法及嗜銀蛋白染色分析法觀察培養(yǎng)12 h，1、2、4 和8 d 的細(xì)胞活力。 (3) 用Fluo-3/A

5、M、LSCM 及FCM 觀察FNZ、CPH 及FNZ 和CPH 聯(lián)合作用對(duì)脂褐素形成模型中12 h，1、2、4 和8 d 胞內(nèi)鈣離子變化的影響；用MTT 比色法及嗜銀蛋白染色分析法觀察培養(yǎng)12 h，1、2、4 和8 d 的細(xì)胞活力。 結(jié)果： (1) LSCM 結(jié)果：與POS 培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度在12 h 達(dá)到高峰值777.33 ± 63.86 U (P<0.01), 之后下降，但至8 d 仍維持在較高值334.1

6、2 ±30.55 U (P<0.01)；對(duì)照組為165.36 ± 29.92 U。細(xì)胞內(nèi)脂褐素自發(fā)熒光平均強(qiáng)度在培養(yǎng)8 d 達(dá)到350.24 ± 26.49 U，而對(duì)照組為105.51± 15.39 U (P<0.01)。 FCM 結(jié)果：對(duì)照組RPE 胞內(nèi)鈣離子熒光值為11.1 ± 0.36，共培養(yǎng)后在12 h達(dá)到最大值69.3 ± 0.75 (P<0.01)，之后下降，但于8 d 仍維持于42.3 ± 0.44(P<0.01)

7、。脂褐素?zé)晒庵惦S培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增高，在共培養(yǎng)8 d 達(dá)到23.5± 0.36, 和對(duì)照組(3.6 ± 0.24) 相比較有顯著性差異(P<0.01) 。MTT 法顯示共培養(yǎng)細(xì)胞相對(duì)增殖率于1 d 達(dá)到最大值84.4％，之后下降。AgNORs 分析結(jié)果：和對(duì)照組相比，和牛POS 共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組RPE 細(xì)胞胞核內(nèi)AgNORs 顆粒數(shù)目增多，在2 d 達(dá)到最高值4.2 (P<0.01)，后隨時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，在8d降到3.6。 (

8、2) LSCM 及FCM 結(jié)果：和對(duì)照組相比，各FNZ 組對(duì)各時(shí)間點(diǎn)鈣離子內(nèi)流均有抑制作用(P<0.05)，脂褐素?zé)晒庵翟? d 和8 d 和對(duì)照組相比具有顯著差異，但和濃度并不完全呈劑量相關(guān)性，25 μmol/L FNZ 組作用最強(qiáng)。MTT比色分析及AgNORs 分析結(jié)果：不同濃度FNZ 對(duì)于共培養(yǎng)引起的1 d 細(xì)胞活力的顯著增強(qiáng)具有抑制作用(P<0.05)，并隨FNZ 濃度加大，抑制作用增強(qiáng)。 (3) LSCM 及FCM 結(jié)

9、果： FNZ 組及FNZ + CPH 聯(lián)用組鈣離子熒光值對(duì)于共培養(yǎng)過(guò)程發(fā)生的鈣超載具有一定程度的抑制作用(P<0.01)。FNZ 和CPH聯(lián)用組抑制作用最強(qiáng)。各組對(duì)于共培養(yǎng)后4 d ~ 8 d 脂褐素的形成均有一定抑制作用(P<0.05)。以FNZ 和CPH 聯(lián)用組抑制作用最強(qiáng)，8 d 為125.01 ± 18.79，而對(duì)照組為350.24 ± 26.49 (P<0.01)。MTT 比色分析及AgNORs 分析結(jié)果：各組對(duì)于共培養(yǎng)對(duì)照組

10、1 d ~ 2 d 細(xì)胞活力的顯著增強(qiáng)均具有一定抑制作用。 和對(duì)照組相比，F(xiàn)NZ + CPH 聯(lián)用組抑制作用最強(qiáng)(P<0.01)，且作用后4 d~8 d細(xì)胞活力仍保持上升趨勢(shì)。 結(jié)論：在培養(yǎng)人RPE 細(xì)胞和牛POS 共培養(yǎng)形成脂褐素過(guò)程中，鈣離子大量?jī)?nèi)流，其變化可能在脂褐素產(chǎn)生及蓄積過(guò)程中起到重要的作用，并刺激細(xì)胞的增殖活力。鹽酸氟桂利嗪和鹽酸甲氯芬酯合用可以抑制RPE 脂褐素形成過(guò)程中的鈣超載及脂褐素形成，并保持細(xì)胞活