Integrinβ4在氣道上皮細胞應(yīng)激反應(yīng)功能穩(wěn)態(tài)中的作用及其機制研究.pdf

1、目的：氣道上皮細胞是呼吸系統(tǒng)與外界接觸的第一道天然屏障，越來越多的研究表明氣道上皮細胞可以通過自身的機械性屏障功能、分泌功能、代謝功能與抗原呈遞功能等過程參與對呼吸系統(tǒng)的應(yīng)激反應(yīng)及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。因此，氣道上皮的結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)態(tài)是呼吸系統(tǒng)維持正常換氣功能和防御功能的細胞基礎(chǔ)。氣道上皮細胞是一層排列緊密的假復(fù)層上皮細胞，通過細胞與細胞之間以及細胞與基底膜之間的粘附氣道上皮細胞整齊排列并粘附在基底膜上。氣道上皮的結(jié)構(gòu)性整合粘附依賴于氣道上皮

2、表達的粘附分子家族。Integrinβ4是氣道上皮細胞表達的一類結(jié)構(gòu)性粘附分子蛋白，通過半橋粒結(jié)構(gòu)介導(dǎo)氣道上皮細胞與基底膜的粘附及整合。與整合素其它家族成員不同，integrinβ4胞內(nèi)含有一段特殊的結(jié)構(gòu)性功能域，提示其可能參與氣道上皮細胞的一系列信號通路，進而與氣道上皮的應(yīng)激反應(yīng)、功能穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。但是，除了粘附功能以外，integrinβ4在氣道上皮的表達及功能屬性的相關(guān)研究很少。本實驗室在先前的研究中應(yīng)用基因芯片及生物信息學(xué)方法篩

3、選了哮喘病人外周血白細胞差異表達的粘附分子，發(fā)現(xiàn)integrinβ4基因在哮喘病人中表達明顯下調(diào)，提示integrinβ4表達改變可能與哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病密切相關(guān)，但具體的內(nèi)在機制仍不清楚。因此，本課題研究主要包括以下幾個部分：
　　 (1)Integrinβ4在氣道上皮細胞氧化應(yīng)激、損傷修復(fù)中的作用；
　　 (2)Integrinβ4在哮喘病人氣道黏膜的表達及與哮喘發(fā)病的相關(guān)性；
　　 (3)Integr

4、inβ4與臭氧應(yīng)激后AHR發(fā)病的相關(guān)性；
　　 (4)Integrinβ4對氣道上皮細胞抗原呈遞及淋巴細胞分化的調(diào)節(jié)。
　　 方法與結(jié)果：
　　 1)Integrinβ4在氣道上皮細胞氧化應(yīng)激及損傷修復(fù)中的作用體外培養(yǎng)的人支氣管上皮細胞株(16HBE14o-)及原代大鼠氣道上皮細胞(RTE)，分別用臭氧攻擊30 min，免疫組化及流式檢測顯示，臭氧應(yīng)激后，integrin p4在16HBE140-及RTE細胞上的

5、表達明顯上調(diào)。建立OVA應(yīng)激的大鼠哮喘模型，抗氧化能力檢測顯示活性氧自由基在OVA應(yīng)激后的大鼠氣道上皮細胞中含量明顯增加，免疫組化及realtime RT-PCR.結(jié)果顯示integrinβ4在OVA模型大鼠的氣道上皮表達下調(diào)，以上結(jié)果提示integrinβ4可能參與了氣道上皮細胞的氧化應(yīng)激過程。
　　 另外，我們觀察了integrinβ4在機械損傷后的氣道上皮細胞的表達，在生長融合的16HBE14o-及RTE細胞培養(yǎng)板上機械刮

6、擦形成一個損傷區(qū)域，12h后免疫細胞化學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)在機械損傷邊緣的氣道上皮細胞呈現(xiàn)遷移趨勢，integrinβ4在損傷邊緣的上皮細胞表達顯著上調(diào)，提示integrinβ4可能參與了氣道上皮的損傷修復(fù)過程。
　　 為闡明integrinβ4在氣道上皮細胞損傷修復(fù)及氧化應(yīng)激過程中的作用，我們利用integrinβ4高表達載體和integrinβ4沉默載體建立integrinβ4在RTE細胞中的高表達和沉默細胞系，籍此觀察integri

7、nβ4在氣道上皮細胞氧化應(yīng)激及損傷修復(fù)中的作用。損傷修復(fù)能力用損傷修復(fù)指數(shù)測定，增殖由MTT法測定?？寡趸芰叭N抗氧化酶的表達通過相應(yīng)的試劑盒檢測。結(jié)果顯示integrinβ4表達上調(diào)可明顯促進RTE的損傷修復(fù)能力，其調(diào)節(jié)能力可能與上皮細胞的增殖能力相關(guān)。另外，integrinβ4的表達水平與RTE的抗氧化能力密切相關(guān)，其表達上調(diào)可增進RTE的總抗氧化能力，進一步結(jié)果提示integrinβ4對RTE抗氧化能力的調(diào)節(jié)與GSH-Px，S

8、OD，catalase三種抗氧化酶的表達水平相關(guān)。
　　 以上結(jié)果提示integrinβ4作為經(jīng)典的結(jié)構(gòu)性粘附分子在氣道上皮細胞組成性表達，其表達受各種刺激因素敏感調(diào)節(jié)。除結(jié)構(gòu)性粘附功能外，integrinβ4還參與到對氣道上皮細胞的損傷修復(fù)、抗氧化能力等過程的調(diào)節(jié)。在OVA應(yīng)激后的哮喘模型中，氣道上皮細胞integrinβ4表達明顯下調(diào)，進而誘導(dǎo)氣道上皮細胞損傷修復(fù)過程減慢，抗氧化能力降低，與OVA應(yīng)激后的哮喘表型緊密相關(guān)。因

9、此，我們推斷integrinβ4可能與哮喘、變應(yīng)性鼻炎等氣道上皮性疾病的發(fā)病相關(guān)。
　　 2)Integrinβ4在哮喘病人氣道黏膜的表達及其與哮喘發(fā)病的相關(guān)性本實驗室在先前的研究中應(yīng)用基因芯片及生物信息學(xué)方法篩選了哮喘病人外周血差異表達的粘附分子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)integrinβ4基因在所有哮喘病人中表達均下調(diào)。Integrinβ4是一類經(jīng)典的結(jié)構(gòu)性粘附分子，它在氣道上皮細胞組成性表達維持氣道上皮的結(jié)構(gòu)及功能完整。哮喘病人氣道上皮表

10、現(xiàn)為明顯的結(jié)構(gòu)損傷及上皮脫落，提示可能存在粘附分子成員的表達缺陷。因此我們推測integrinβ4在哮喘病人的氣道黏膜可能存在差異表達并與哮喘發(fā)病相關(guān)。為探討integrinβ4在支氣管肺組織的分布表達及其與哮喘發(fā)病的相關(guān)性，這一部分工作我們觀察了integrinβ4在正常人及哮喘病人的氣道粘膜的表達。
　　 免疫組化結(jié)果顯示，在正常人的氣道黏膜，上皮結(jié)構(gòu)完整，上皮細胞排列整齊，integrinβ4組成性高表達。在哮喘病人的氣道

11、黏膜，上皮細胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷，上皮細胞松動脫落明顯，integrinβ4的膜內(nèi)及膜外蛋白表達明顯下調(diào)。為進一步研究哮喘病人氣道黏膜integrinβ4表達下調(diào)與哮喘發(fā)病的相關(guān)性。我們設(shè)計并篩選integrinβ4特異性siRNA(small interference)序列，進一步構(gòu)建包裝為慢病毒載體，在16HBE14o-沉默integrinβ4基因后，觀察16HBE14o-在integrinβ4表達下調(diào)后粘附能力、損傷修復(fù)過程、細胞周期及

12、細胞凋亡的變化。結(jié)果顯示integrinβ4沉默后，16HBE14o-粘附率明顯減低，細胞增殖周期被抑制，大量細胞停留在G1期，S期細胞明顯減少，G2/G1減小，損傷修復(fù)速度減慢，細胞凋亡明顯增加。
　　 以上結(jié)果提示integrinβ4在哮喘病人氣道上皮細胞表達明顯下調(diào)，進而誘發(fā)了氣道上皮細胞的粘附率降低，G1期阻止，損傷修復(fù)速度減慢，細胞活力降低，凋亡率增加，與哮喘病人氣道上皮細胞病理改變的臨床表型及發(fā)病機制密切相關(guān)。

13、>　　 3)Integrinβ4與臭氧應(yīng)激誘導(dǎo)的AHR(airway hyperresponsiveness，氣道)發(fā)病的相關(guān)性AHR是哮喘，變應(yīng)性鼻炎等呼吸系統(tǒng)疾病的主要臨床表現(xiàn)之一。大量的動物實驗及離體實驗研究發(fā)現(xiàn)AHR的發(fā)病與氣道上皮細胞的結(jié)構(gòu)完整及功能穩(wěn)態(tài)相關(guān)。本研究第二部分結(jié)果顯示，integrinβ4在哮喘病人的氣道黏膜表達特異性下調(diào)，誘導(dǎo)氣道上皮的增殖抑制，損傷修復(fù)減慢，與哮喘病人氣道上皮細胞的病理改變密切相關(guān)。我們推測

14、integrinβ4缺陷表達誘導(dǎo)的上皮細胞功能失穩(wěn)態(tài)可能與AHR的誘發(fā)有關(guān)。
　　 為研究integrinβ4表達與AHR之間可能存在的內(nèi)在聯(lián)系，我們建立了臭氧攻擊不同時間誘導(dǎo)的AHR動物模型。在臭氧攻擊不同時間點，分別檢測臭氧攻擊誘導(dǎo)的的氣道反應(yīng)性和integrinβ4的表達水平。RL(lung resisitence)由Buxco小動物呼吸功能測量系統(tǒng)檢測，結(jié)果提示，臭氧攻擊后可誘發(fā)明顯的AHR，AHR程度伴隨臭氧攻擊時間的

15、增長而更加明顯。臭氧攻擊結(jié)束后，AHR改變逐漸減弱回復(fù)正常。免疫組化及real time RT-PCR定量檢測integrinβ4表達水平，結(jié)果顯示臭氧攻擊后，integrinβ4蛋白及mRNA表達水平伴隨臭氧攻擊而逐漸下調(diào)，臭氧攻擊結(jié)束后，integrinβ4表達逐漸上升恢復(fù)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示臭氧攻擊AHR模型中，組胺激發(fā)后的RL水平與integrinβ4表達水平呈明顯負相關(guān)，提示臭氧攻擊后AHR的誘發(fā)可能與integrinβ4表達

16、密切相關(guān)。體外沉默integrinβ4在16HBE14o-的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)integrinβ4下調(diào)后16HBE14o-抗細胞氧化能力減弱，細胞凋亡明顯增加。
　　 以上結(jié)果提示，臭氧攻擊大鼠后誘發(fā)明顯AHR病變。Integrinβ4在臭氧攻擊后的大鼠氣道上皮表達明顯下調(diào)，進而誘導(dǎo)氣道上皮細胞抗氧化能力減弱，細胞凋亡增加，可能與臭氧攻擊后AHR發(fā)病相關(guān)。
　　 4)Integrinβ4對氣道上皮細胞抗原呈遞及淋巴細胞分化的

17、調(diào)控氣道上皮在抗原應(yīng)激后可識別抗原并進行抗原呈遞，進而誘導(dǎo)氣道局部的淋巴細胞增殖分化，故氣道上皮細胞的抗原呈遞過程與氣道局部的免疫炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)。哮喘病人氣道黏膜局部表現(xiàn)為典型的Th2型淋巴細胞炎癥反應(yīng)，本研究第二部分結(jié)果顯示，integrinβ4在哮喘病人氣道上皮表達下調(diào)，且與哮喘病人氣道上皮細胞的結(jié)構(gòu)功能失穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)。我們推測哮喘病人氣道上皮細胞integrinβ4表達下調(diào)可能參與對氣道上皮細胞抗原呈遞過程的調(diào)節(jié)，進而與哮喘病人

18、氣道局部T淋巴細胞分化及Th2型炎癥表型相關(guān)。為驗證以上假設(shè)，本研究觀察了integrinβ4下調(diào)對氣道上皮細胞的抗原呈遞能力及T淋巴細胞的增殖及分化的影響。
　　 免疫熒光實時定量觀察結(jié)果顯示integrinβ4沉默后氣道上皮細胞對外界抗原的識別及攝取能力明顯減慢；對照上皮細胞和integrinβ4沉默上皮細胞分別與T淋巴細胞共培養(yǎng)，用CFSE-DA標(biāo)記T淋巴細胞檢測淋巴細胞增殖，ELISA(enzyme linked imm

19、unosorbent assay)檢測共培養(yǎng)后細胞上清液中的細胞因子含量。結(jié)果顯示：與正常上皮細胞+淋巴細胞共培養(yǎng)體系相比，與integrinβ4沉默氣道上皮細胞+T淋巴細胞共培養(yǎng)體系中T淋巴細胞活化增殖能力降低，共培養(yǎng)體系上清液中Th1型細胞因子IFN-gamma減少，Th1/Th2比值降低。
　　 以上結(jié)果提示integrinβ4在哮喘病人氣道黏膜的表達下調(diào)誘導(dǎo)氣道上皮細胞抗原呈遞能力減弱，并抑制氣道黏膜局部T淋巴細胞Th1

20、性增殖分化，與哮喘病人氣道黏膜局部的Th2型炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 Integrinβ4在氣道上皮細胞組成性表達，其表達受各種外界刺激敏感調(diào)節(jié)。除結(jié)構(gòu)性粘附功能外，integrinβ4參與對氣道上皮細胞損傷修復(fù)、抗氧化等生理功能穩(wěn)態(tài)的維持與調(diào)節(jié)。Integrinβ4在哮喘病人氣道上皮及哮喘模型動物氣道上皮表達下調(diào)，導(dǎo)致上皮結(jié)構(gòu)性損傷及功能失穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)AHR，調(diào)控氣道局部的淋巴細胞向 Th2型炎癥反應(yīng)增殖分