氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B中人抗原R對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化調(diào)控作用的研究.pdf

1、背景:
　　慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)是一種在世界范圍內(nèi)都有頗高發(fā)病率、病死率的呼吸道疾患。2017年更新的慢性阻塞性肺疾病全球倡議(GOLD)指南中指出，COPD是一種由有毒的顆?；驓怏w損傷氣道及肺組織而引起的疾病，不再單獨(dú)提及慢性炎癥反應(yīng)這一因素。在發(fā)病機(jī)制描述方面，指南除肯定了氧化應(yīng)激、蛋白酶破壞、炎癥反應(yīng)等先前的共識(shí)外，非炎癥機(jī)制對(duì)COPD發(fā)病的重要性

2、得到人們的日益關(guān)注。非炎癥機(jī)制包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)活化、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常和E-鈣粘蛋白流失等，以上機(jī)制同時(shí)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）的發(fā)生密切相關(guān)。
　　EMT是指上皮細(xì)胞經(jīng)過一系列變化后最終轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂虚g質(zhì)細(xì)胞特點(diǎn)細(xì)胞的過程。研究表明，EMT與組織纖維化、組織重塑、腫瘤發(fā)生以及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等病理改變有關(guān)。有證據(jù)顯示，EMT與包括COPD在內(nèi)的多種纖維化

3、肺疾病存在密切關(guān)系。EMT作為COPD發(fā)病的潛在機(jī)制，在氣道重塑、纖維化甚至惡變中都發(fā)揮了作用，具有重要的研究?jī)r(jià)值。
　　EMT的調(diào)控涉及諸多信號(hào)通路、轉(zhuǎn)錄因子，共同構(gòu)成了復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，臨床藥物研究多針對(duì)單一途徑，很難達(dá)到調(diào)控目的。人抗原R(humanantigenR，HuR)是一種廣為研究的RNA結(jié)合蛋白，可以與多種蛋白的信使RNA(mRNA)結(jié)合，并通過影響其穩(wěn)定性或者翻譯過程發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。研究表明，HuR參與了多種

4、EMT相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)控，但是在COPD中，HuR是否參了與EMT的調(diào)控以及能否通過調(diào)控HuR來影響EMT進(jìn)程目前尚無有關(guān)報(bào)導(dǎo)。
　　目的:
　　本文旨在明確HuR在COPD患者氣道上皮中的表達(dá)水平，以及在香煙煙霧提取物(CSE)刺激的氣道上皮BEAS-2B中的表達(dá)及活性情況，在細(xì)胞水平探討HuR對(duì)EMT的調(diào)控作用。
　　方法:
　　免疫組織化學(xué)法檢測(cè)人肺臟組織氣道上皮中HuR的表達(dá)情況，并量化分析與患者一秒用力

5、呼氣容積(FEV1)的相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照不吸煙組、對(duì)照吸煙組、COPD吸煙組;實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞株(BEAS-2B)，采用香煙煙霧提取物(CSE)刺激方式模擬COPD致病狀態(tài)，蛋白印跡法檢測(cè)不同CSE刺激條件下HuR表達(dá)水平;蛋白印跡法、免疫熒光法檢測(cè)HuR活性，根據(jù)CSE刺激時(shí)間，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、3小時(shí)組、6小時(shí)組和9小時(shí)組;采用小RNA干擾技術(shù)抑制HuR表達(dá)，分別應(yīng)用定量實(shí)時(shí)熒光PCR及蛋白印跡法檢測(cè)抑制表達(dá)效率;CSE刺激

6、BEAS-2B及干擾HuR表達(dá)后，蛋白印跡法、免疫熒光法檢測(cè)E-鈣粘蛋白、波形蛋白表達(dá)情況，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察BEAS-2B細(xì)胞形態(tài)變化，實(shí)驗(yàn)主要分為對(duì)照組、CSE組和CSE+HuR干擾組;干擾HuR表達(dá)后，檢測(cè)EMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子鋅指E盒結(jié)合蛋白1（ZEB-1）的mRNA衰減速率，CSE刺激及干擾HuR表達(dá)后，檢測(cè)ZEB-1表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　(1)COPD患者肺臟氣道上皮細(xì)胞中HuR表達(dá)增高
　　免疫組織化學(xué)

7、結(jié)果顯示，COPD吸煙組中HuR表達(dá)顯著高于對(duì)照不吸煙組及對(duì)照吸煙組，對(duì)照吸煙組HuR表達(dá)高于對(duì)照不吸煙組;HuR表達(dá)水平與FEV1存在負(fù)相關(guān)性。
　　(2)CSE刺激下BEAS-2B細(xì)胞系中HuR表達(dá)增高、活性增強(qiáng)
　　BEAS-2B細(xì)胞中，CSE刺激促進(jìn)HuR的表達(dá);蛋白印跡及免疫熒光結(jié)果顯示，CSE刺激后，HuR細(xì)胞質(zhì)分布增加，活性增強(qiáng)。
　　(3)小RNA干擾可明顯降低HuR表達(dá)水平
　　BEAS-2B中

8、轉(zhuǎn)染3組小RNA序列，分別在RNA水平及蛋白水平檢測(cè)HuR表達(dá)，有2組序列HuR表達(dá)均有明顯的下調(diào)。
　　(4)CSE刺激下BEAS-2B細(xì)胞系中HuR在EMT調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用
　　BEAS-2B細(xì)胞中CSE處理后，細(xì)胞出現(xiàn)EMT相關(guān)改變，E-鈣粘蛋白（上皮細(xì)胞標(biāo)志物）表達(dá)降低，波形蛋白（間葉細(xì)胞標(biāo)志物）表達(dá)升高，細(xì)胞形態(tài)有梭形改變;抑制HuR表達(dá)后，EMT標(biāo)志物及細(xì)胞形態(tài)改變均得到部分逆轉(zhuǎn)。
　　(5)HuR介導(dǎo)ZEB