COPD與上皮細胞間質轉化相關性研究.pdf

1、目的：慢性阻塞性肺疾病(COPD)是常見的呼吸系統慢性病，具有高患病率及高死亡率等特點，其發(fā)病機制復雜，可能與多個基因變異相關，動物模型的建立與研究對了解其發(fā)病機制尤為重要。本研究旨在探索并構建新的小鼠COPD模型，并從小鼠一般狀況、肺組織病理變化等多個方面對其進行評估。對上皮細胞間質轉化(EMT)相關標志物（E-cadherin、α-SMA及collagenⅠ）在COPD模型組及對照組中表達情況進行觀察，并進行半定量PCR，初步篩選出

2、與COPD相關的候選基因。在小鼠COPD模型、香煙煙霧提取物(CSE)刺激的人支氣管上皮細胞（16HBE）及相應對照組中通過定量PCR、Dot bolt、Western blot及免疫熒光等檢查，研究該候選基因在其中的表達情況;對myh14在COPD的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮的作用進行探討，為將來進一步研究其在COPD中的具體作用機制打下基礎。
　　方法：⑴通過采用CSE聯合脂多糖(LPS)滴鼻建立小鼠COPD模型，將20只雄性C57/

3、BL6小鼠隨機平均分為正常對照組及COPD模型組，于建模第42天同時處死小鼠，每組隨機選取6只小鼠進行后續(xù)實驗。⑵觀察對照組及模型組的一般情況、肺組織病理變化（HE染色、PAS染色）、肺平均內襯間隔(MLI)及肺泡破壞指數(DI)，免疫組化觀察EMT表現。⑶對支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行細胞分類計數觀察。⑷用兩組小鼠肺組織作為標本進行半定量PCR初步篩選出與COPD相關的候選基因。⑸用定量PCR、Dot blot檢測篩選出的候選基因

4、(myh14)在小鼠肺組織中mRNA及蛋白表達水平。⑹MTT法選擇細胞實驗中最適CSE刺激濃度，按CSE對細胞刺激的不同時間進行分組，用定量PCR及Dot blot檢測myh14在各組細胞中mRNA及蛋白表達水平，并通過免疫熒光法觀察各組細胞中myh14的分布與表達。⑺Western blot檢測CollagenⅠ及α-SMA在COPD模型組及對照組肺組織中的蛋白表達水平。8、COPD模型組進行myh14與E-cadherin、α-SM

5、A、CollagenⅠ之間相關性分析。
　　結果：①一般情況:觀察兩組小鼠毛發(fā)，活動等情況，COPD模型組小鼠較對照組出現活動減少，消瘦，呼吸困難等表現，對照組小鼠存活率100％;模型組存活率為80％。②肺組織病理學及形態(tài)結構變化:對照組氣道及肺泡結構完整、清晰，較少炎性細胞浸潤，肺泡間隔無明顯增厚及斷裂出現。模型組氣道上皮結構紊亂，出現黏液高分泌，肺泡壁斷裂并融合成肺大泡，有較多炎性細胞浸潤。模型組MLI及DI均較對照組升高(P

6、＜0.05)。③BALF細胞分類計數:COPD模型組BALF中細胞總數、中性粒細胞比例均較對照組升高(P＜0.05)。④免疫組化及相關性分析:對照組氣道上皮細胞結構完整，胞漿內可見大量myh14陽性表達，而模型組myh14表達減少(P＜0.05);模型組E-cadherin較對照組減少(P＜0.05);模型組氣道平滑肌增生較對照組明顯;模型組氣道壁膠原沉積明顯，CollagenⅠ表達較對照組增多(P＜0.05)。模型組氣道上皮myh14

7、、E-cadherin平均光密度值(IOD/area)較對照組減少(P＜0.05)，模型組CollagenⅠ平均光密度值(IOD/area)較對照組升高(P＜0.05)。平均光密度值相關性分析顯示模型組myh14與E-cadherin呈正相關(r=0.967，P＜0.01)，與CollagenⅠ呈負相關(r=-0.925，P＜0.01)。⑤半定量PCR篩選COPD相關候選基因結果:經過對兩組小鼠肺組織進行半定量PCR COPD相關候選基

8、因篩選，發(fā)現Slc9a2、Foxj1及Gif在兩組中差異無統計學意義(P＞0.05)，Chrm1、Sprr2b、Rag1、Dusp5、Cldn2、Cldn22、Scin差異有統計學意義(P＜0.05)，Morc3、Rela、Akt1、Pik3r1、IL6ra、Myh14、Tpm3、Crabp2、Sprr2a2、Lyn、Srrm4、C/EBP、Gabarap、Elk1、Hk2、Tjap1、Strada兩組間有明顯差異(P＜0.01)，選取

9、差異明顯的myh14作為COPD相關基因進行后續(xù)實驗。⑥CSE細胞毒性試驗:對不同CSE濃度刺激24h的16HBE細胞進行MTT法檢測各組細胞活性，在CSE濃度≤2.5％時，細胞活性降低不明顯，差異無統計學意義(P＞0.05)，當CSE濃度大于2.5％時，細胞活性出現明顯下降(P＜0.01)。故選用2.5％CSE進行后續(xù)細胞實驗。⑦實時熒光定量PCR: myh14在小鼠COPD模型組中相對mRNA含量（RQ值）較對照組下降(P＜0.05

10、)，CSE對16HBE細胞不同時間刺激(8h、24h)組中myh14mRNA水平均較對照組下降(P＜0.01)，CSE8h及24h刺激組間存在差異，差異具有統計學意義(P＜0.05)。8、Dot blot、Westem blot結果及相關性分析:Dot blot結果顯示，COPD模型組myh14蛋白表達水平較對照組下降(P＜0.05)，Western blot結果顯示模型組中α-SMA及collagenⅠ蛋白表達水平均較對照組升高(P＜

11、0.05);相關性分析顯示模型組中蛋白表達水平上myh14與α-SMA呈負相關(r=-0.833，P＜0.05)，與collagen呈負相關(r=-0.953，P＜0.01)。16HBE細胞經CSE刺激(8h、24h)后，Dot blot顯示myh14在蛋白表達水平上均較對照組明顯下降(P＜0.01)，CSE8h及24h刺激組間存在差異性，差異具有統計學意義(P＜0.05)。9、16HBE細胞中myh14免疫熒光檢測:綠色熒光為myh1

12、4在細胞中的陽性表達，myh14表達于細胞胞漿內，CSE刺激組(8h，24h)較對照組熒光表達明顯減弱(P＜0.01)，不同CSE刺激組間存在差異，且差異存在統計學意義(P＜0.05)。
　　結論：⑴CSE聯合LPS滴鼻可成功構建小鼠COPD模型。⑵COPD中存在EMT現象的發(fā)生。⑶myh14可在人支氣管上皮細胞及小鼠支氣管上皮細胞表達，且在小鼠COPD模型及經CSE刺激的16HBE細胞中存在mRNA及蛋白水平下降。⑷myh14可