心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡與鈣化的相關(guān)性研究.pdf

1、背景:
　　 心臟瓣膜鈣化性病變是常見的心臟瓣膜病理性改變之一。心臟瓣膜發(fā)生嚴(yán)重鈣化后對(duì)心臟血流動(dòng)力學(xué)、心臟瓣膜功能、患者的生活質(zhì)量和預(yù)后均產(chǎn)生產(chǎn)生巨大影響。目前，多數(shù)研究提示在瓣膜間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生鈣化的演變過程中，瓣膜間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的細(xì)胞凋亡，鑒于細(xì)胞凋亡是多基因調(diào)控的主動(dòng)過程，其中caspase-3是凋亡的主要調(diào)控基因，因此細(xì)胞凋亡可能影響并參與了瓣膜間質(zhì)細(xì)胞鈣化過程。根據(jù)基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)凋亡敏感標(biāo)志物caspase-3

2、與mir-30b在3'UTR端存在結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)國(guó)內(nèi)學(xué)者已經(jīng)通過基因芯片檢測(cè)正常心臟組織與其他人體內(nèi)臟器證實(shí)，mir-30b表達(dá)含量在心臟組織中最高，提示caspase-3可能受到mir-30b的調(diào)控繼而影響心臟的生理、病理變化。
　　 目的:
　　 1.通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)明確瓣膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡與鈣化的相關(guān)性并確定caspase-3在瓣膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡調(diào)控中的作用;
　　 2.分析mir-30b與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性，并

3、通過體外過表達(dá)和抑制實(shí)驗(yàn)明確mir-30b對(duì)細(xì)胞生存功能的影響。
　　 方法:
　　 1.瓣膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡在鈣化性心臟瓣膜病瓣膜中的表達(dá)
　　 通過常規(guī)組織學(xué)染色、免疫組織化學(xué)染色、TUNEL、Von Kossa染色、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)瓣膜組織上的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。通過體外分離鑒定瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、Von Kossa染色、Western blot對(duì)細(xì)胞學(xué)上凋亡情況進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 2.瓣膜間質(zhì)細(xì)

4、胞凋亡調(diào)控機(jī)制的初步探討
　　 通過PCR檢測(cè)瓣膜組織中mir-30b的表達(dá)含量，與瓣膜組織中凋亡情況作出相關(guān)性分析。心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染mir-30b mimics或inhibitors后，在體外，使用Annexin V-FITC/PI對(duì)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞雙染后通過流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，通過caspase-3活性檢測(cè)進(jìn)一步確定mir-30b對(duì)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡能力的影響，通過CCK-8檢測(cè)mir-30b對(duì)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞株增殖能

5、力的影響。Western blot檢測(cè)調(diào)控mir-30b后細(xì)胞水平上凋亡相關(guān)基因caspase-3的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.瓣膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡在鈣化性心臟瓣膜病瓣膜中的表達(dá)
　　 常規(guī)組織學(xué)病理分析顯示鈣化是鈣化性心臟瓣膜病瓣膜的主要病變，并伴隨紅色膠原纖維含量增高而藍(lán)色的彈力纖維斷裂、含量降低。通過TUNEL1技術(shù)檢測(cè)，鈣化性瓣膜中細(xì)胞凋亡率顯著高于無(wú)鈣化瓣膜，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。免疫組織

6、化學(xué)檢測(cè)鈣化性瓣膜中凋亡關(guān)鍵基因caspase-3陽(yáng)性率顯著高于無(wú)鈣化瓣膜，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)caspase-3是多基因調(diào)控的主動(dòng)過程，是凋亡的主要調(diào)控基因。
　　 2.瓣膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制的初步探討
　　 通過real-time PCR檢測(cè)，mir-30b在鈣化性瓣膜中的表達(dá)下降，在無(wú)鈣化瓣膜組織中的表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。Mir-30b相對(duì)表達(dá)量與瓣膜組織細(xì)胞凋

7、亡率呈負(fù)相關(guān)，下調(diào)mir-30b的表達(dá)可顯著增加瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的凋亡，下調(diào)mir-30b的表達(dá)可顯著抑制瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的增殖能力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。mir-30b的目標(biāo)靶基因?yàn)榈蛲鲫P(guān)鍵基因caspase-3，下調(diào)mir-30b的表達(dá)可導(dǎo)致caspase-3表達(dá)顯著增高(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)上，鈣化性心臟瓣膜病瓣膜的鈣化程度與瓣膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡率增加具有相關(guān)性。