Notch1蛋白在人心臟瓣膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡與鈣化關(guān)系中的作用.pdf

1、背景：
　　鈣化性瓣膜性心臟?。–alcified valvular heart disease, CVHD）是老年人最常見(jiàn)的心臟瓣膜病，在老年人群中CVHD是引起心力衰竭、心律失常、暈厥、猝死等疾病的常見(jiàn)原因之一。在所有心血管疾病中，主動(dòng)脈瓣疾病的發(fā)病僅次于高血壓和冠狀動(dòng)脈疾病，而主動(dòng)脈瓣疾病中最常見(jiàn)的是主動(dòng)脈瓣鈣化性狹窄，瓣膜置換是目前唯一有效的治療措施，尚無(wú)特效藥物治療。過(guò)去認(rèn)為主動(dòng)脈瓣鈣化(Aortic valve cal

2、cification,AVC)是退行性病變，但是隨著近年的研究發(fā)現(xiàn)，其是一個(gè)主動(dòng)的進(jìn)行性的病理過(guò)程，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。有研究表明主動(dòng)脈瓣的鈣化過(guò)程與骨形成的鈣化過(guò)程極其相似，而細(xì)胞凋亡在骨形成的鈣化過(guò)程中起著重要的促進(jìn)作用。在血管平滑肌細(xì)胞的鈣化過(guò)程中，凋亡有著啟動(dòng)整個(gè)血管鈣化過(guò)程的作用。人主動(dòng)脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞(Aortic valve interstitial cells，AVICs)作為心臟瓣膜三層結(jié)構(gòu)中最主要的細(xì)胞類(lèi)型，在瓣

3、膜的病變中起最重要的作用，參與瓣膜鈣化的全過(guò)程。研究證實(shí)Notch1信號(hào)通路可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞鈣化，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）活化Notch1信號(hào)通路表達(dá)后可使AVICs鈣化加重。有研究指出在腫瘤細(xì)胞中Notch1可以通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，可以推測(cè)Notch1蛋白可能通過(guò)誘導(dǎo)AVICs凋亡，最終促進(jìn)了瓣膜鈣化，但目前尚無(wú)相關(guān)研究。本研究通過(guò)鈣化誘導(dǎo)液［β-甘油磷酸、抗壞血酸、地塞米

4、松、重組型人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein2，BMP-2)］建立AVICs鈣化模型，研究Notch1的表達(dá)及細(xì)胞凋亡與AVICs鈣化的相關(guān)性。然后用LPS活化Notch1蛋白的表達(dá)，γ分泌酶抑制劑(DAPT)抑制Notch1蛋白表達(dá)，揭示Notch1蛋白在AVICs凋亡與鈣化關(guān)系中的重要作用。為鈣化性瓣膜病的藥物治療提供了可能的作用新靶點(diǎn)。
　　目的：
　　1.用鈣化誘導(dǎo)液（重組型人B

5、MP-2蛋白50μg/L、地塞米松100nmol/L、L-抗壞血酸50mg/L、β-甘油磷酸5mmol/L）刺激體外培養(yǎng)的人瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，建立體外鈣化模型，為體外探討瓣膜鈣化機(jī)制提供模型。檢測(cè)鈣化動(dòng)態(tài)過(guò)程中Notch1蛋白及細(xì)胞凋亡的表達(dá)，探究AVICs鈣化與Notch1蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。
　　2.在體外細(xì)胞鈣化模型的基礎(chǔ)上通過(guò)脂多糖(LPS)活化Notch1蛋白的表達(dá)，DAPT抑制Notch1蛋白的表達(dá)，檢測(cè)AVICs

6、鈣化及細(xì)胞凋亡的變化，探究Notch1蛋白在AVICs凋亡與鈣化關(guān)系中的作用。
　　方法：
　　1.瓣膜間質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)鈣化及鈣化過(guò)程中Notch1蛋白、細(xì)胞凋亡表達(dá)
　　將體外培養(yǎng)的AVICs以1×105/ml的密度種植于12孔板內(nèi)，隨機(jī)分為兩組，鈣化組和空白對(duì)照組，鈣化組細(xì)胞再按誘導(dǎo)天數(shù)的不同，分1天組、3天組、5天組、7天組4個(gè)亞組。每組均為3孔。鈣化組加200μl鈣化誘導(dǎo)液及800μl I-GRO PLUS培養(yǎng)

7、基(含10%胎牛血清）按不同天數(shù)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；空白對(duì)照組用1ml I-GRO PLUS培養(yǎng)基(含10%胎牛血清）培養(yǎng)；所有細(xì)胞均培養(yǎng)7天，7天后統(tǒng)一收取標(biāo)本。用Von Kossa染色、Western Blot、ELISA檢測(cè)細(xì)胞鈣化的表達(dá)。用Western Blot、PT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞鈣化過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)Notch1蛋白及基因的表達(dá)；用熒光染色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞鈣化過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡情況。
　　2. Notch1蛋白在

8、AVICs凋亡與鈣化關(guān)系中的作用
　　取第一部分實(shí)驗(yàn)中鈣化誘導(dǎo)細(xì)胞，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（即第一部分實(shí)驗(yàn)中的鈣化誘導(dǎo)細(xì)胞）；LPS組：在對(duì)照組細(xì)胞的基礎(chǔ)上加0.2mg/L（4μl/孔）LPS，以上調(diào)Notch1蛋白的表達(dá)；DAPT組：在對(duì)照組的基礎(chǔ)上加50μmol/L（4μl/孔）DAPT，抑制Notch1蛋白的表達(dá)；3組細(xì)胞均培養(yǎng)3天。用Western Blot檢測(cè)Notch1、BMP-4、Casepase3蛋白的表達(dá)，以了解激

9、活/抑制Notch1信號(hào)通路后AVICs鈣化及凋亡變化。
　　結(jié)果：
　　1．瓣膜間質(zhì)細(xì)胞體外誘導(dǎo)鈣化及鈣化過(guò)程中Notch1蛋白、細(xì)胞凋亡表達(dá)
　　光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)7天的空白對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，呈放射狀排列，無(wú)顆粒物沉積；鈣化組細(xì)胞交錯(cuò)排列，呈網(wǎng)狀生長(zhǎng)，細(xì)胞核顏色變深，細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)黑色顆粒狀沉積物。Von Kossa染色后鈣化組細(xì)胞鈣化節(jié)結(jié)(57.3±7.2/孔)較空白對(duì)照組(10.2±3.3/孔)顯著增多(P＜

10、0.05)，且隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)目也隨之增加；Western-Blot及ELISA法檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)鈣化組細(xì)胞鈣化的分子標(biāo)志物BMP4的表達(dá)高于空白對(duì)照組（P＜0.05），隨著鈣化誘導(dǎo)天數(shù)增加，BMP4蛋白的表達(dá)量增加。細(xì)胞鈣化動(dòng)態(tài)過(guò)程中RT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Notch1基因在鈣化組的表達(dá)均較空白對(duì)照組高（P＜0.05），Western Blot測(cè)定Notch1蛋白表達(dá)的結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，且Notch1基因表達(dá)增高的時(shí)間

11、（鈣化誘導(dǎo)1天后）早于Notch1蛋白及細(xì)胞凋亡(鈣化誘導(dǎo)3天后)表達(dá)。熒光顏色及流式細(xì)胞儀檢測(cè)均證實(shí)誘導(dǎo)3天組細(xì)胞凋亡比例最高（20.78%），顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），隨后有下降趨勢(shì)，所有數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2. Notch1蛋白在AVICs凋亡與鈣化關(guān)系中的作用
　　Western Blot檢測(cè)證實(shí)DAPT組細(xì)胞內(nèi)Notch1蛋白的表達(dá)較對(duì)照組減弱(P＜0.05)，LPS組Notch1蛋白的表達(dá)與對(duì)照組相

12、比明顯增多(P＜0.05)，LPS組與DAPT組相比，Notch1蛋白的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LPS活化Notch1信號(hào)通路后，Caspase3及BMP4蛋白的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)及DAPT組(P＜0.001)；DAPT抑制Notch1表達(dá)后，Caspase3及BMP4蛋白的表達(dá)明顯較對(duì)照組下降(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.成功在體外建立了AVICs鈣化模