Notch-1在食管鱗狀細(xì)胞癌上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用研究.pdf

1、目的:
　　TGF-β1誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)后，通過DAPT下調(diào)Notch-1信號通路，探討Notch-1在食管鱗狀細(xì)胞癌EMT中的作用。
　　方法:
　　1.利用TGF-β1誘導(dǎo)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞(Eca-109)發(fā)生EMT，篩選TGF-β1最佳誘導(dǎo)濃度。分別加入0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/mlTGF-β1，48h后CCK-8檢測細(xì)

2、胞活力，Western-blotting檢測E-cadherin、Vimentin的表達(dá)變化。
　　2.探索Notch-1信號通路在食管鱗狀細(xì)胞癌EMT中的效應(yīng)，篩選DAPT最佳抑制濃度，分別加入0μM、5μM、10μM、15μM、20μM DAPT，48h后CCK-8檢測細(xì)胞活力，Western-blotting檢測E-cadherin、Vimentin的表達(dá)變化。
　　3.探尋DAPT下調(diào)Notch-1信號通路后對食管鱗

3、狀細(xì)胞癌EMT的作用。實(shí)驗(yàn)分為Control、DMSO、DMSO+TGF-β1、TGF-β1、TGF-β1+DAPT、DAPT組，48h后IF檢測E-cadherin、Vimentin的表達(dá)，Western-blotting檢測Notch-1ICD、Hes-1表達(dá)改變;4W后結(jié)晶紫染色，細(xì)胞克隆計(jì)數(shù);觀察Eca-109細(xì)胞0h、6h、12h、24h遷移能力變化。
　　結(jié)果:
　　1.蛋白質(zhì)免疫印跡檢測E-cadherin與V

4、imentin的表達(dá)情況，在TGF-β1-5ng/ml組中，E-Cadherin表達(dá)量顯著減少，與Control組、0.5、1、2ng/ml組比較有顯著性差異(P＜0.05)，與10ng/ml組比較無顯著性差異(P＞0.05); Vimentin表達(dá)量顯著增多，與Control組、0.5、1、2ng/ml組比較有顯著性差異(P＜0.05)，與10ng/ml組比較無顯著性差異(P＞0.05)，篩選出TGF-β1誘導(dǎo)Eca-109發(fā)生EMT

5、最佳濃度為5ng/ml。
　　2.在DAPT(15μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)組中，E-Cadherin蛋白表達(dá)量顯著增多，與Control組、DAPT(5/10μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)組比較有顯著性差異(P＜0.05)，與DAPT(20μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)組比較無顯著性差異(P＞0.05);Vimentin蛋白表達(dá)量顯著減少，與Control組、DAPT(5/10

6、μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)組比較有顯著性差異(P＜0.05)，與DAPT(20μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)組比較無顯著性差異(P＞0.05)，篩選DAPT最佳抑制濃度為15μmol/ml。
　　3.Notch-1 ICD與Hes-1的表達(dá)情況，在TGF-β1(5ng/ml)組，蛋白表達(dá)量顯著增多，與DMSO(5μl)+TGF-β1(5ng/ml)組比較，無顯著性差異(P＞0.05)，與Cont

7、rol(0μmol/ml)組、DMSO(5μl)組、DAPT(15μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)組、DAPT(15μmol/ml)組比較有顯著性差異(P＜0.05);在DAPT(15μmol/ml)+ TGF-β1(5ng/ml)組蛋白顯著減少，與Control(0μmol/ml)組、DMSO(5μl)組、DMSO(5μl)+ TGF-β1(5ng/ml)、TGF-β1(5ng/ml)組、DAPT(15μmol/ml)組

8、比較有顯著性差異(P＜0.05)。
　　4.E-cadherin與Vimentin的在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位，E-cadherin表達(dá)于細(xì)胞膜、Vimentin表達(dá)于細(xì)胞漿，細(xì)胞核也有少量表達(dá)。
　　5.下調(diào)Notch-1信號通路后，Eca-109克隆結(jié)果提示在TGF-β1(5ng/ml)組的克隆個(gè)數(shù)最多，與DMSO(5μl)+TGF-β1(5ng/ml)組比較，無顯著性差異(P＞0.05)，與Control(0μmol/ml)組

9、、DMSO(5μl)組、DAPT(15μmol/ml)+ TGF-β1(5ng/ml)組、DAPT(15μmol/ml)組比較有顯著性差異。在DAPT(15μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)組中，Eca-109克隆形成率及個(gè)數(shù)明顯減少，與Control(0μmol/ml)組、DMSO(5μl)組、DMSO(5μl)+TGF-β1(5ng/ml)、TGF-β1(5ng/ml)組、DAPT(15μmol/ml)組比較有顯著性差異

10、(P＜0.05)。
　　6.下調(diào)Notch-1信號通路后，劃痕實(shí)驗(yàn)顯示Eca-109在TGF-β1(5ng/ml)組的遷移距離最遠(yuǎn)，與DMSO(5μl)+TGF-β1(5ng/ml)組比較，無顯著性差異(P＞0.05)，與Control(0μmol/ml)組、DMSO(5μl)組、DAPT(15μmol/ml)+TGF-β(5ng/ml)組、DAPT(15μmol/ml)組比較有顯著性差異。在DAPT(15μmol/ml)+TGF