RACK1在食管鱗癌預(yù)后及進(jìn)展中的作用及與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分、RACK1在人體食管鱗癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性分析
　　背景：食管癌是我國最為常見的消化道惡性腫瘤之一。世界衛(wèi)生組織最新的惡性腫瘤流行病學(xué)報(bào)告顯示，我國食管癌的發(fā)病及死亡人數(shù)均超出世界一半以上;每年中國大陸食管癌新發(fā)病例28.7萬例，發(fā)病率為21.88/10萬，居各類惡性腫瘤第5位;死亡20.8萬例，死亡率為15.85/10萬，居第4位。我國食管癌發(fā)病的組織類型與西方國家明顯不同，95％以上為食管鱗癌(esoph

2、ageal squamous cell cancer，ESCC)，而西方國家則腺癌多發(fā)。我國人口基數(shù)大，加之食管癌發(fā)病率高，為更好地研究食管鱗癌提供了優(yōu)勢資源。盡管近年來治療技術(shù)不斷進(jìn)步，但因食管癌惡性程度高、發(fā)展快、復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)，加之手術(shù)切除難度大、藥物治療效果欠佳等因素，食管癌患者的5年生存率仍不超過14％。改善預(yù)后是目前食管癌治療亟待解決的問題，而尋找特異性與敏感性較高的預(yù)后指標(biāo)，并以其為指導(dǎo)開展和實(shí)施個(gè)體化治療，使每位患者最大

3、程度的治療獲益，這也是目前食管癌治療的最終目標(biāo)。
　　激活的蛋白激酶C受體1(receptor for activated C kinase1，RACK1)分子是一種錨定蛋白，含有7個(gè)WD-40結(jié)構(gòu)域，RACK1分子通過該結(jié)構(gòu)域和其他的分子結(jié)合，共同形成復(fù)合物，進(jìn)而發(fā)揮各種病理及生理功能。人RACK1基因是高度保守的，含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，位于人的5號(hào)染色體上(5q35.3)，因RACK1的七個(gè)β螺旋組成的空間結(jié)構(gòu)可以提供多

4、種蛋白結(jié)合位點(diǎn)，故可為多種蛋白之間的相互作用提供作用表面。RACK1既可以作為PKC的錨定蛋白，還可以招募其它蛋白，發(fā)揮支架蛋白的作用。
　　RACK1可以與多種信號(hào)分子結(jié)合，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要的作用，并可參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，與腫瘤的關(guān)系十分密切，研究發(fā)現(xiàn)RACK1在人惡性腫瘤中可表達(dá)上調(diào)，例如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、口腔鱗癌等，并且其表達(dá)水平與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況相關(guān)。不僅如此，RACK1還被證實(shí)可以預(yù)測多種惡

5、性腫瘤的預(yù)后，如乳腺癌、肝癌、口腔鱗癌等。但是作為中國發(fā)病率較高的食管鱗癌，RACK1與此種惡性腫瘤的預(yù)后關(guān)系目前研究甚少。
　　目的：
　　1.研究RACK1蛋白在人食管鱗癌組織中的表達(dá)情況;
　　2.探討食管鱗癌患者中RACK1蛋白的表達(dá)與患者長期預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象
　　收集自2007年1月至2007年12月來我院胸外科行食管癌手術(shù)的患者，2007年在我院有238例患者行食

6、管癌手術(shù)，術(shù)前無任何輔助治療的患者納入本次研究。所有入組病例必須有明確病理診斷為食管鱗癌，且有胸部及腹部CT結(jié)果。病例收集時(shí)須詳細(xì)記錄患者的性別、年齡、腫瘤發(fā)病部位、病變長度、腫瘤最大直徑、TNM分期、分化程度、治療方案等，并加以分析。排除標(biāo)準(zhǔn):病理類型為非鱗癌;缺乏病理診斷結(jié)果;術(shù)前曾行輔助治療;術(shù)后30天內(nèi)死亡;不配合以致難以獲得完整病例資料。最終有100例患者納入本研究，其中男性患者79例，女性患者21例，年齡中位數(shù)為60歲。

7、r>　　2.數(shù)據(jù)隨訪
　　采用電話隨訪的形式，自我院病案室收集患者病歷資料時(shí)記錄患者聯(lián)系方式，對(duì)入組患者進(jìn)行隨訪。隨訪截止時(shí)間為2013年1月31日。
　　3.標(biāo)本采集
　　根據(jù)住院號(hào)及病理號(hào)自我院病理科查詢?nèi)虢M患者的手術(shù)石蠟標(biāo)本，選擇手術(shù)切除的腫瘤部位行病理切片，同時(shí)選取腫瘤周圍組織行病理切片，用作對(duì)照。切片厚度約為5μm。
　　4.免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判斷按照方法3中操作獲得病理切片后，我們對(duì)其進(jìn)行免疫組織

8、化學(xué)染色，選擇5個(gè)具有代表性的高倍視野(10×40倍)，計(jì)數(shù)IHC標(biāo)記定位準(zhǔn)確的陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的比例并記分。細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞數(shù)的0％記為0分，1％-24％記為1分，25％-49％記為2分，50％-74％記為3分，75％以上記為4分;染色強(qiáng)度以無著色、弱、中、強(qiáng)分類，依次記為0，1，2，3分;最后計(jì)算兩種記分的乘積，所得結(jié)果可為:0、1、2、3、4、6、8、9、12，將0-4列為RACK1陰性表達(dá)組，6-12列為RACK1陽性表達(dá)組。

9、
　　結(jié)果：
　　1.RACK1蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況RACK1蛋白在人體食管鱗癌組織中的主要著色部位在細(xì)胞漿，偶見細(xì)胞核著色。根據(jù)RACK1表達(dá)情況將患者分為陽性表達(dá)和陰性表達(dá)兩組，100例患者中RACK1蛋白陽性表達(dá)者有59例，陰性表達(dá)者有41例。
　　陽性表達(dá)組患者中男性占47例，女性占12例，陰性表達(dá)組患者中男性占32例，女性占9例，男性發(fā)病率較高，符合食管癌發(fā)病特點(diǎn)，但是并未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的水平(P=

10、0.846)。陽性表達(dá)組患者平均年齡為61.9歲，陰性表達(dá)組患者平均年齡為60.4歲，兩組患者年齡無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P=0.416。另外兩組患者的發(fā)病部位、N分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率是否大于0.2、TNM分期、組織學(xué)分化程度、治療方案也無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)比兩組患者，我們發(fā)現(xiàn)患者的腫瘤長度(P=0.012)、腫瘤直徑小于3cm的比例(P=0.047)、T分期(P=0.032)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.038)差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義水平。
　　2.

11、RACK1蛋白組織表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示RACK1陽性表達(dá)患者的總體生存率為27.1％，而RACK1陰性表達(dá)患者為56.1％，log-rank檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)總體生存率差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.002。在無進(jìn)展生存率方面，RACK1陽性表達(dá)組也顯著低于陰性表達(dá)組，差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)水平，P=0.001。
　　對(duì)影響患者總體生存率和無進(jìn)展生存率的各因素進(jìn)行單因素分析后將RACK1表達(dá)、T分期

12、、N分期、淋巴結(jié)陽性、陽性淋巴結(jié)比率以及TNM分期(P值均小于0.05)納入進(jìn)行多因素分析。多因素分析后發(fā)現(xiàn)，RACK1表達(dá)（RACK1陰性:HR0.532，95％ CI0.301-0.942，P=0.030）是影響患者總體生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。在患者無進(jìn)展生存率方面上，RACK1表達(dá)(RACK1陰性:HR0.523，95％ CI0.294-0.929，P=0.027)是患者的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　結(jié)論：
　　1.RACK1在

13、食管鱗癌組織中存在差異表達(dá);
　　2.RACK1陽性表達(dá)患者總體生存率和無進(jìn)展生存率均低于陰性表達(dá)患者，RACK1高表達(dá)患者預(yù)后差。
　　第二部分、RACK1與食管鱗癌進(jìn)展的相關(guān)性研究
　　背景：食管癌預(yù)后較差的原因有很多，除了篩查診斷手段的不完善和治療失敗，進(jìn)展較快也是一個(gè)很重要的因素，而高侵襲性和高轉(zhuǎn)移傾向的生物學(xué)行為特點(diǎn)則是食管癌病程進(jìn)展的根本原因。因此，我們迫切需要深入理解食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找治療新靶點(diǎn)

14、。鑒于我國食管癌發(fā)病的病理類型中鱗癌發(fā)生率較高，我們以食管鱗癌為對(duì)象展開研究。
　　RACK1作為銜接蛋白，可以招募各種信號(hào)通路有關(guān)的因子或蛋白，參與信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，進(jìn)而調(diào)整細(xì)胞周期或者細(xì)胞凋亡等，最終實(shí)現(xiàn)其對(duì)腫瘤進(jìn)展的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)RACK1通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路的活性進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，還通過與RhoA的相互作用繼而活化RhoA/Rho激酶通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移，此外RACK1能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞中Ki-Ras介導(dǎo)的信

15、號(hào)通路，并能影響細(xì)胞形態(tài)。然而由于RACK1可以與多種蛋白分子結(jié)合，其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移能力等的影響并不一致，RACK1可以抑制細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)的磷酸化，延緩細(xì)胞周期進(jìn)程，發(fā)揮抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長的作用。
　　我們前期研究發(fā)現(xiàn)RACK1表達(dá)與人體食管鱗癌的腫瘤直徑是否小于3cm、腫瘤長度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，根據(jù)我們的前期研究成果及現(xiàn)有的報(bào)道，我們推測RACK1與

16、食管鱗癌進(jìn)展有關(guān)，RACK1的表達(dá)水平可以影響食管癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。
　　目的：
　　1.構(gòu)建RACK1基因穩(wěn)定敲減的食管癌細(xì)胞系;
　　2.檢測RACK1基因敲減后食管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的改變;
　　3.檢測PKC激活劑或抑制劑預(yù)處理后食管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的改變。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　用添加了10％胎牛血清的高糖型DMEM培養(yǎng)Eca109及EC970

17、6細(xì)胞株，置于37℃、5％CO2、95％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.shRNA轉(zhuǎn)染及穩(wěn)篩根據(jù)RACK1的基因序列，委托上海吉瑪生物有限公司設(shè)計(jì)合成shRNA及其干擾表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo。根據(jù)Invitrogen公司的轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000的操作說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。用G418對(duì)轉(zhuǎn)染后的食管鱗癌Eca109和EC9706細(xì)胞進(jìn)行篩選。建立RACK1穩(wěn)定敲減的細(xì)胞系。
　　3.細(xì)胞接受藥物預(yù)

18、處理細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長時(shí)，用完全培養(yǎng)基配置佛波酯PMA/TPA，調(diào)整濃度至100nM，并以此更換細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)20小時(shí)后更換為新鮮完全培養(yǎng)基。同樣方法加入星孢菌素staurosporine(SP)。
　　4.細(xì)胞總蛋白提取及Western Blot用RIPA裂解液處理細(xì)胞并將產(chǎn)物經(jīng)14000rpm4℃離心10min，收集上清液獲得總蛋白。應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液并煮沸使蛋白變性，凝膠電泳分離，將分離所得蛋白條帶通過

19、轉(zhuǎn)移電泳轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5％脫脂奶粉室溫封閉2小時(shí)，依次加一抗二抗孵育。次日用ECL化學(xué)發(fā)光法對(duì)蛋白條帶進(jìn)行檢測。
　　5.克隆實(shí)驗(yàn)
　　用0.25％胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，計(jì)數(shù)、接種，常規(guī)培養(yǎng)2-3周，出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng)。用0.1％的結(jié)晶紫溶液室溫染色1小時(shí)、顯微鏡下計(jì)數(shù)。
　　6.裸鼠移植瘤模型及移植瘤伊紅-蘇木素(HE)染色取處于對(duì)數(shù)生長的

20、細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/ml。用1ml注射器抽吸0.2ml細(xì)胞懸液注入裸鼠后背部，每五天測量腫瘤的長徑a和短徑b，腫瘤體積計(jì)算公式為Vmm3=a×b2×0.5。根據(jù)腫瘤體積繪制腫瘤的生長曲線。4周后處死老鼠，小心剝離腫塊，游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積。將移植瘤標(biāo)本制成病理切片，進(jìn)行HE染色。
　　7.Transwell遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)用無血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，取細(xì)胞懸液200μl加入Transwell小室，下室加入

21、500μl含胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)后，用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)需要首先包被基底膜，其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.食管癌細(xì)胞中RACK1的表達(dá)及RACK1敲減的驗(yàn)證Western Blot驗(yàn)證了RACK1在人食管癌細(xì)胞系Eca109和EC9706中均表達(dá)，RT-PCR發(fā)現(xiàn)shRNA轉(zhuǎn)染后RACK1mRNA表達(dá)量降低，Western Blot進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染后兩種細(xì)胞中RACK1蛋白水平的降低。

22、
　　2.RACK1基因敲減后食管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力變化的檢測體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)RACK1基因敲減后，Eca109和EC9706增殖能力降低?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組克隆形成數(shù)明顯降低(Eca109P=0.0044; EC9706 P=0.0008)。裸鼠移植瘤模型進(jìn)一步證明了此結(jié)果，RACK1穩(wěn)定敲減后的細(xì)胞所形成的移植瘤的瘤重(Eca109 P=0.0003; EC9706P=0.0029)、瘤體積(

23、Eca109 P=0.0119; EC9706 P=0.0192)均顯著低于對(duì)照組。
　　Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)RACK1基因敲減后Eca109和EC9706遷移、侵襲能力降低。RACK1敲減后的Eca109細(xì)胞和EC9706細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)均顯著小于對(duì)照組(Eca109 P=0.0108，EC9706 P=0.0037)。RACK1敲減后的Eca109細(xì)胞和EC9706細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著小于對(duì)照組(Eca109 P=0.00

24、14，EC9706 P=0.0133)。
　　3.PKC激活劑PMA/TPA、 PKC抑制劑staurosporine(SP)分別預(yù)處理食管癌細(xì)胞后其增殖、遷移、侵襲能力變化的檢測PMA預(yù)處理后的Eca109和EC9706的細(xì)胞克隆數(shù)顯著高于未行預(yù)處理的細(xì)胞，(Eca109 P=0.0012; EC9706 P=0.0015)，SP預(yù)處理組則顯著低于對(duì)照組(Eca109 P=0.0016; EC9706 P=0.0059)。裸鼠移

25、植瘤實(shí)驗(yàn)中，PMA預(yù)處理后的Eca109和EC9706細(xì)胞形成的移植瘤瘤重、瘤體積均顯著高于對(duì)照組（瘤重:兩組細(xì)胞P＜0.0001;瘤體積:Eca109 P=0.0288，EC9706 P=0.0405），SP預(yù)處理組則顯著低于對(duì)照組(瘤重:Eca109 P=0.0001，EC9706 P=0.0002;瘤體積:Eca109P=0.0308, EC9706 P=0.0103)。
　　PMA預(yù)處理組Eca109和EC9706的遷移細(xì)

26、胞數(shù)顯著高于對(duì)照組(Eca109P=0.0040; EC9706 P=0.0015)，SP預(yù)處理組則顯著低于對(duì)照組(Eca109 P=0.0012;EC9706 P=0.0006)。PMA預(yù)處理組Eca109和EC9706的侵襲細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組(Eca109 P=0.0448; EC9706 P=0.0138)，SP預(yù)處理組則顯著低于對(duì)照組(Eca109P=0.0049; EC9706 P=0.0007)。
　　結(jié)論：

27、　　1.RACK1敲減后食管癌細(xì)胞Eca109和EC9706的增殖能力降低，所形成的裸鼠移植瘤的重量及體積降低，細(xì)胞的遷移、侵襲能力降低。
　　2.PKC激活劑PMA/TPA預(yù)處理食管癌細(xì)胞Eca109和EC9706后，細(xì)胞的增殖能力升高，裸鼠成瘤能力升高，細(xì)胞遷移、侵襲能力升高，而SP預(yù)處理細(xì)胞后則均降低。
　　第三部分、RACK1在食管鱗癌進(jìn)展中的作用機(jī)制與EMT的相關(guān)性的初步探討
　　背景：食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)

28、連續(xù)過程，涉及腫瘤細(xì)胞粘附性下降、基質(zhì)降解、腫瘤細(xì)胞遷移和新生血管形成等多個(gè)環(huán)節(jié)。研究表明，癌細(xì)胞主要通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)獲得遷移、侵襲能力，進(jìn)而突破基底膜發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，癌細(xì)胞經(jīng)歷EMT后粘附性下降或消失，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，從而獲得突破基底膜、侵襲周圍組織的能力，進(jìn)入淋巴或血管到達(dá)遠(yuǎn)處臟器，通過間質(zhì)上

29、皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal epithelial transition，MET)形成新的腫瘤即轉(zhuǎn)移瘤。體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證明了癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移前有EMT的發(fā)生。這些都提示，EMT是腫瘤早期轉(zhuǎn)移啟動(dòng)過程中的重要組成部分，阻斷EMT的發(fā)生可能抑制腫瘤早期轉(zhuǎn)移。
　　RACK1的多蛋白結(jié)合表面賦予了其功能多樣化的生物學(xué)特性，RACK1可以與多種因子結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力、侵襲能力、增殖及抗凋亡能力等，發(fā)揮其調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展的

30、作用。在第二部分的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，RACK1可以促進(jìn)食管鱗癌增殖、侵襲和遷移，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。而EMT作為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要途徑，是否參與了RACK1促進(jìn)食管鱗癌進(jìn)展的過程，目前研究甚少。
　　已有報(bào)道證實(shí)，人乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)RACK1可以引起EMT過程中間質(zhì)標(biāo)志物（Vimentin和α-SMA）表達(dá)的上調(diào)及上皮標(biāo)志物（E-Cadherin和CK-19）表達(dá)的下調(diào)。結(jié)合前期結(jié)果和已有的報(bào)道，我們推測EMT可能參與了RACK1

31、促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的過程。
　　目的：
　　探討RACK1促進(jìn)食管鱗癌進(jìn)展是否與EMT有關(guān)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞總蛋白提取及Western Blot方法同前。
　　2.免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判斷方法同前。
　　結(jié)果：
　　1.食管癌細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin的表達(dá)與RACK1表達(dá)的相關(guān)性與對(duì)照組相比較，RACK1敲減后Eca109和EC9706細(xì)胞E-cadherin表達(dá)水平升

32、高，Vimentin表達(dá)水平降低。
　　2.食管鱗癌組織E-cadherin和Vimentin的表達(dá)與RACK1表達(dá)的相關(guān)性患者食管鱗癌組織中E-cadherin表達(dá)與RACK1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Vimentin表達(dá)與RACK1的表達(dá)呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　食管鱗癌細(xì)胞及組織中RACK1表達(dá)與EMT標(biāo)志物E-cadherin和Vimentin表達(dá)有關(guān)，與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與Vimentin表達(dá)呈正相關(guān)