香煙煙霧暴露誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)及其修復(fù)機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居各類腫瘤之首，是嚴(yán)重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤。我國(guó)是煙草消費(fèi)大國(guó)，特別是近年來(lái)，隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程的加速，空氣污染日趨嚴(yán)重，肺癌發(fā)病不容樂(lè)觀。據(jù)我國(guó)近期公布的中國(guó)腫瘤發(fā)病率和死亡率統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌是我國(guó)發(fā)病率最高的癌癥，并呈現(xiàn)較快的增長(zhǎng)趨勢(shì)，是嚴(yán)重危害我國(guó)城鄉(xiāng)人口健康的重大疾病。
　　吸煙被認(rèn)為是引起肺癌最重要的環(huán)境因素，據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)報(bào)道，吸煙者肺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較非吸煙者高近10倍，

2、而及時(shí)戒煙可降低肺癌發(fā)生率。香煙煙霧中含有數(shù)千種化學(xué)物質(zhì)，其中包含多種致癌物質(zhì)，如芳香烴類、N-亞硝胺類、雜環(huán)胺、甲醛等，同時(shí)還包含一氧化氮、一氧化碳、硫化氫等在內(nèi)的多種有害氣體及重金屬和放射性物質(zhì)。此外，二手煙暴露亦被認(rèn)為是肺癌發(fā)生的重要環(huán)境因素，二手煙中含有苯并芘、N-亞硝胺等在內(nèi)的250余種有毒有害物質(zhì)。吸煙被認(rèn)為具有誘導(dǎo)生命體抗氧化能力下降和干擾DNA損傷修復(fù)能力，最終導(dǎo)致腫瘤、心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)退行性病變等多種疾病的發(fā)生。<

3、br>　　DNA是染色體主要組成成分，是生命體主要遺傳物質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性是維持細(xì)胞正常生理功能的基礎(chǔ)。各種內(nèi)源性和外源性因素均可引起DNA損傷，DNA損傷后細(xì)胞啟動(dòng)修復(fù)或誘導(dǎo)凋亡。然而，當(dāng)細(xì)胞對(duì)DNA損傷修復(fù)的異常反應(yīng)可導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。吸煙是肺癌最重要的危險(xiǎn)因素，然而吸煙引起肺癌的機(jī)制仍不清楚。本研究擬探討香煙煙霧暴露與氣道上皮細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的潛在聯(lián)系，從而為肺癌的防治提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　第

4、一部分 香煙煙霧暴露誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)
　　目的：探討香煙煙霧暴露是否可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞DNA損傷反應(yīng)(DDR)，并進(jìn)一步探討氣道上皮細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機(jī)制。
　　方法：香煙煙霧提取物(CSE)干預(yù)人體正常氣道上皮細(xì)胞HBE，利用流式細(xì)胞技術(shù)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK8法檢測(cè)CSE對(duì)HBE細(xì)胞增殖和凋亡的影響。分別利用β-半乳糖苷酶染色、免疫熒光染色法和吉姆薩染色法，觀察CSE干預(yù)HBE后細(xì)胞的衰老反應(yīng)、DDR和染

5、色體結(jié)構(gòu)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)CSE干預(yù)對(duì)HBE的細(xì)胞周期影響。DNA纖維形成實(shí)驗(yàn)探討香煙煙霧暴露后氣道上皮細(xì)胞DNA復(fù)制速度變化。Western Blot分析CSE干預(yù)后，DNA損傷修復(fù)蛋白XRCC1、RPA、USP1及范可尼家族蛋白的表達(dá)水平，Q-PCR方法觀察HBE細(xì)胞經(jīng)香煙煙霧暴露后FANCD2、FANCI的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果：CSE可抑制HBE細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)HBE細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)濃度和劑量依賴效應(yīng)。HBE細(xì)胞經(jīng)CSE干

6、預(yù)后染色體斷裂增加，細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的DDR。但本實(shí)驗(yàn)條件下，未觀察到CSE誘導(dǎo)的HBE細(xì)胞衰老反應(yīng)。CSE作用HBE細(xì)胞后，G1期細(xì)胞數(shù)量增加，且DDR多發(fā)生于CyclinA陽(yáng)性細(xì)胞，提示DDR發(fā)生可能與DNA復(fù)制相關(guān)。DNA纖維形成實(shí)驗(yàn)表明，CSE干預(yù)后HBE細(xì)胞DNA復(fù)制速度下降，多集中在0.2kb/min～0.8kb/min，而對(duì)照組DNA復(fù)制速度主要分布于0.6kb/min～1.2kb/min。此外，CSE可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中范

7、可尼家族蛋白FANCD2和FANCI的表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：香煙煙霧暴露可降解FANCD2、FANCI蛋白，誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞DDR。
　　第二部分 IL-17促進(jìn)香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定和DNA損傷反應(yīng)
　　目的：探討IL-17是否參與了香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定和DNA損傷反應(yīng)(DDR)。
　　方法：C57BL/6小鼠與IL-17-/-小鼠分別隨機(jī)分成香煙煙霧暴露組與對(duì)照組，每組數(shù)量在10只以上，實(shí)驗(yàn)

8、組小鼠置于香煙煙霧暴露裝置中（Teague Enterprises）。每日香煙煙霧暴露總量為100支，每周暴露5天。暴露12周后，收集小鼠肺泡灌洗液(BALF)和肺、腦、食管、心臟、肝臟、脾、腎、胃、腸、膀胱組織。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)小鼠BALF中細(xì)胞DDR，HE染色觀察小鼠各臟器病理形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化學(xué)染色法(IHC)觀察各臟器的DDR，并檢測(cè)IL-17的表達(dá)及其與DDR的相關(guān)性。免疫熒光染色分析IL-17干預(yù)后HBE細(xì)胞的DDR，并

9、探討ATM與ATR是否參與了IL-17誘導(dǎo)的DDR。IHC觀察吸煙與不吸煙者肺組織和膀胱組織DDR與IL-17表達(dá)，并分析二者的相關(guān)性。
　　結(jié)果：香煙煙霧暴露12周后，C57BL/6小鼠肺和膀胱組織出現(xiàn)DDR，而腦、食管、心臟、肝臟、脾、腎、胃、腸組織均未發(fā)生明顯的DDR。HE染色提示香煙煙霧暴露引起肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺組織DDR與炎癥評(píng)分有潛在聯(lián)系。香煙煙霧暴露C57BL/6小鼠后，肺組織和膀胱組織IL-17表達(dá)上調(diào)，且與D

10、DR呈正相關(guān)。香煙煙霧暴露IL-17-/-小鼠12周后，其肺組織DDR較香煙煙霧暴露的野生型小鼠明顯下降。IL-17可體外誘導(dǎo)HBE細(xì)胞DDR，ATM與ATR抑制劑可有效阻斷IL-17誘導(dǎo)的HBE細(xì)胞H2AX磷酸化。與不吸煙者相比，吸煙者肺組織和膀胱組織DDR與IL-17表達(dá)增高，且二者之間存在顯著的相關(guān)性。
　　結(jié)論：IL-17促進(jìn)了香煙煙霧暴露誘導(dǎo)的多臟器基因組不穩(wěn)定與DDR。
　　第三部分 吸煙誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激DNA損傷

11、反應(yīng)與肺癌高度相關(guān)
　　目的：探討吸煙與不吸煙肺癌和非癌對(duì)照患者肺組織氧化應(yīng)激DNA損傷反應(yīng)水平。
　　方法：免疫熒光染色觀察CSE干預(yù)氣道上皮細(xì)胞后8-OHdG的表達(dá)水平變化。C57BL/6小鼠隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)組小鼠置于香煙煙霧暴露裝置中。香煙煙霧分別暴露12周與24周后，收集肺組織標(biāo)本。同時(shí)，收集88例因肺部疾病行氣管鏡檢查的患者肺泡灌洗液(BALF)，并收集病人一般資料。所有納入研究者均獲得病理學(xué)診斷，其中有50例肺癌患

12、者和38例良性對(duì)照，兩組之間在性別、年齡、吸煙史上無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ELISA法檢測(cè)BALF中8-OHdG表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)染色(IHC)法評(píng)價(jià)肺組織8-OHdG表達(dá)水平，分別比較吸煙與不吸煙的肺癌及非癌對(duì)照患者肺組織的氧化應(yīng)激DNA損傷反應(yīng)。
　　結(jié)果：體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，香煙煙霧暴露誘導(dǎo)HBE細(xì)胞和小鼠肺組織8-OHdG表達(dá)增加，暴露24周小鼠比12周小鼠的肺組織存在更高的氧化應(yīng)激DNA損傷反應(yīng)。肺癌患者BALF中8-OHdG

13、濃度為5.4±0.6ng/ml，非癌對(duì)照組為2.3±0.4ng/ml，兩組之間具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.0002)。根據(jù)病理分型，磷癌、腺癌、小細(xì)胞肺癌BALF中8-OHdG表達(dá)水平均較非癌對(duì)照組高，且BALF電，8-OHdG表達(dá)水平與TNM分期密切相關(guān)。此外，肺癌和非癌對(duì)照組BALF中8-OHdG濃度在吸煙者中分別較不吸煙者增高，并與吸煙指數(shù)呈正相關(guān)。IHC結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了BALF中的研究發(fā)現(xiàn)。當(dāng)BALF中8-OHdG表達(dá)水平為2