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文檔簡介
1、本文從以下幾部分進行了詳細闡述。
第一部分糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的亮氨酸拉鏈蛋白(GILZ)在人氣道上皮細胞9HTE中的表達。
目的:明確糖皮質(zhì)激素(GCs)地塞米松(DEX)誘導(dǎo)GILZ在人氣道上皮細胞9HTE中的表達。
方法:RT-PCR及Western Blot法檢測DEX在不同時間點6小時、12小時及24小時作用后GILZ mRNA及蛋白的表達情況,同時細胞免疫熒光法檢測GILZ蛋白的定位。
結(jié)果
2、:正常情況下,GILZ mRNA及蛋白在人氣道上皮細胞9HTE的表達較低,而在DEX作用下GILZ mRNA及蛋白的表達均出現(xiàn)明顯改變,6小時即明顯增高,24小時仍持續(xù)高表達,同時觀察到GILZ蛋白在9HTE細胞中主要定位在細胞質(zhì)。
結(jié)論:DEX能夠快速并明顯誘導(dǎo)人氣道上皮細胞9HTE中GILZmRNA及蛋白的表達。
第二部分小干擾RNA(s-RNA)沉默GILZ的篩選及鑒定。
目的:通過si-RNA技術(shù)設(shè)
3、計合成三條GILZ siRNAs并篩選出GILZ沉默效果最佳的一條si-RNA用于后續(xù)實驗。
方法:設(shè)計并合成三條GILZ siRNAs:GILZ1 si-RNA、GILZ2 si-RNA及GILZ3 si-RNA,通過脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染進人氣道上皮細胞9HTE,于沉默48小時后,收集細胞用Realtime-PCR、Westem Blot及細胞免疫熒光法篩選并鑒定出沉默效果最佳的一條GILZ si-RNA。
結(jié)果
4、:通過對GILZ1 si-RNA、GILZ2 si-RNA及GILZ3 si-RNA三條GILZ siRNAs的轉(zhuǎn)染,篩選出GILZ3 si-RNA為最佳的一條GILZsi-RNA,Realtime-PCR檢測GILZ基因沉默效率平均可達55.8%,而通過Western Blot及細胞免疫熒光的檢測發(fā)現(xiàn)其蛋白沉默效果顯著。
結(jié)論:通過si-RNA技術(shù),成功合成鑒定獲得一條沉默效果最佳的GILZ si-RNA,此為用于后續(xù)實驗的
5、關(guān)鍵。
第三部分GILZ介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素抑制氣道上皮細胞修復(fù)的研究。
目的:探討GILZ介導(dǎo)GCs對MAPK-ERK信號通路、增殖及遷移的影響,明確其對氣道上皮細胞修復(fù)的抑制作用。
方法:在non-specific si-RNA及GILZ si-RNA轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞,Western Blot法檢測人氣道上皮細胞9HTE中Raf-1、Mek1/2、Erk1/2(MAPK-ERK信號通路因子)磷酸化蛋白及
6、其總蛋白的表達, MTT、CFSE標記法檢測細胞增殖情況,細胞劃痕及transwell法檢測細胞遷移情況。
結(jié)果:DEX抑制了人氣道上皮細胞9HTE中MAPK-ERK信號通路Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白的表達,而對總蛋白的表達無明顯影響,即抑制了MAPK-ERK信號通路的激活,同時也觀察到DEX抑制了細胞的增殖和遷移。而GILZ si-RNA轉(zhuǎn)染進人氣道上皮細胞9HTE,GILZ的表達被抑制后,DEX對氣道
7、上皮細胞MAPK-ERK信號通路、增殖及遷移的抑制作用均明顯減輕。
結(jié)論:DEX能夠抑制MAPK-ERK信號通路的激活、增殖及遷移,從而抑制了氣道上皮細胞的修復(fù)作用,而DEX的這一抑制作用主要是通過GILZ介導(dǎo)的。
第四部分維生素A對糖皮質(zhì)激素抑制氣道上皮細胞修復(fù)的干預(yù)研究。
目的:明確維生素A(VitA)在人氣道上皮細胞9HTE中對GCs抑制氣道上皮細胞修復(fù)的影響。
方法:通過DEX及全反式維甲
8、酸(ATRA)2干預(yù)24h后,ELISA法檢測人氣道上皮細胞9HTE培養(yǎng)上清液中EGF的表達,細胞免疫熒光及 Western Blot法檢測EGFR及磷酸化EGFR的表達;同時Western Blot檢測人氣道上皮細胞9HTE中Raf-1、Mek1/2、Erk1/2(MAPK-ERK信號通路因子)磷酸化蛋白及其總蛋白的表達,MTT法檢測細胞增殖情況,細胞劃痕及transwell實驗檢測細胞遷移情況。
結(jié)果:ATRA對人氣道上皮
9、細胞9HTE EGF的分泌無明顯影響,但對EGFR及其磷酸化的蛋白的表達有促進作用。ATRA同時也增加了MAPK-ERK信號通路Raf-1、Mek1/2、Erk1/2磷酸化蛋白的表達從而減輕了DEX對MAPK-ERK信號通路激活的抑制作用;ATRA在早期對細胞增殖無明顯影響,但明顯促進了9HTE細胞的遷移。
結(jié)論:ATRA能夠誘導(dǎo)EGFR磷酸化蛋白的表達從而激活EGFR信號通路,這也激活了下游的MAPK-ERK信號通路并促進了
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