香煙對人肺泡上皮細(xì)胞HDAC功能和糖皮質(zhì)激素反應(yīng)的影響及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、COPD是一種具有氣流受限特征的疾病,這種氣流受限不完全可逆,常呈進(jìn)行性發(fā)展,與肺部對有害氣體或有毒顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān).迄今為止,尚缺乏有效遏制COPD進(jìn)展的治療藥物.吸入糖皮質(zhì)激素雖然在哮喘的治療中具有顯著療效,但現(xiàn)有研究結(jié)果表明,它不能有效遏制COPD的氣道炎癥,減緩COPD的疾病進(jìn)展以及降低死亡率.故在COPD中可能存在糖皮質(zhì)激素反應(yīng)的降低.真核生物中,構(gòu)成核小體的核心組蛋白氨基末端的乙?；揎棇虻霓D(zhuǎn)錄具有重要的調(diào)控作用.

2、糖皮質(zhì)激素抗炎作用的發(fā)揮有賴于它對促炎癥基因轉(zhuǎn)錄的抑制.這一過程是通過其與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP1等結(jié)合的具有潛在HAT、活性的共活化分子(CBp/p300、PCAF等)的相互作用,并有效募集HDAC2到激活的共活化分子復(fù)合物部位使已乙酰化的核心組蛋白去乙?；瘉韺?shí)現(xiàn)的.研究顯示,吸煙和氧化應(yīng)激均能增加肺泡巨噬細(xì)胞的核心組蛋白乙?；⒓せ畲傺装Y基因的轉(zhuǎn)錄,該作用與細(xì)胞內(nèi)HDAC2的表達(dá)下調(diào)有關(guān).同時(shí),糖皮質(zhì)激素對IL-1β介導(dǎo)的TNF-

3、α和IL-8表達(dá)的抑制作用在吸煙者的肺泡巨噬細(xì)胞中明顯減弱,因此HDAC分子的表達(dá)及其功能可能與糖皮質(zhì)激素反應(yīng)間存在十分密切的關(guān)系.然而這種關(guān)系在肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞中的情況及其分子機(jī)制仍不明確,有待深入研究. 第一部分 香煙煙霧提取物的制備與檢測及其對人肺泡上皮樣細(xì)胞A549的增殖抑制作用 目的:建立CSE制備和檢測定標(biāo)的方法,觀察其對人肺泡上皮樣細(xì)胞A549細(xì)胞增殖的影響,探討其中可能的分子機(jī)制. 方法:制作基于恒流蠕

4、動(dòng)泵的CSE制備裝置,應(yīng)用反相高效液相色譜檢測CSE中穩(wěn)定成分尼古丁的含量.利用MTT法和LDH法觀察CSE對A549細(xì)胞增殖的影響.通過熒光顯微鏡觀察CSE對A549細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,經(jīng)Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,揭示CSE對A549細(xì)胞增殖影響的可能機(jī)制. 結(jié)果:經(jīng)反相高效液相色譜檢測制備的CSE中尼古丁的含量為369.2±21.6μg/ml(CV 5.9﹪,n=6).CSE對A549細(xì)胞具有明顯細(xì)胞

5、增殖抑制作用,這種作用呈時(shí)間依賴和濃度依賴性,其作用24hr的IC<,50>值為37.7﹪,95﹪可信區(qū)間為29.1﹪～34.6﹪;IC<,5>值為5.1﹪,95﹪可信區(qū)間為1.6﹪～8.1﹪.經(jīng)吖啶橙和碘化丙啶雙染熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),CSE呈濃度依賴的增加A549細(xì)胞的壞死率,而對細(xì)胞的凋亡影響不大,其中10﹪CSE刺激組細(xì)胞壞死率為7.3﹪±3.3﹪,細(xì)胞凋亡率為3.8﹪±1.1﹪:25﹪CSE刺激組細(xì)胞壞死率為34.4﹪±6.7﹪

6、,細(xì)胞凋亡率為3.8﹪±1.1﹪.進(jìn)一步對凋亡相關(guān)蛋白caspase3和caspase9的蛋白表達(dá)水平檢測發(fā)現(xiàn),兩者均未出現(xiàn)較對照組表達(dá)水平明顯的變化.而對凋亡抑制蛋白survivin和XIAP的蛋白表達(dá)水平檢測表明,CSE可以呈濃度依賴的增加survivin和XIAP的表達(dá),但兩者的趨勢并不完全一致,在25﹪CSE刺激時(shí)survivin的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯下調(diào),而XIAP則無.同時(shí)對IкB及其磷酸化水平的檢測發(fā)現(xiàn),兩者在CSE刺激后與對

7、照組比較無表達(dá)水平的改變,而且胞漿與胞核的RelA/p65表達(dá)水平亦基本一致,不受CSE刺激的影響.香煙通過酪氨酸硝基化和SUMO化降低A549細(xì)胞HDAC 2的活性和糖皮質(zhì)激素反應(yīng) 第二部分 香煙通過酪氨酸硝基化和SUMO化降低A549細(xì)胞HDAC 2的活性和糖皮質(zhì)激素反應(yīng) 目的:觀察csE對A549細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)、組蛋白H4乙?；癄顟B(tài)與HDAC2蛋白表達(dá)和功能之間的關(guān)系,并用地塞米松干預(yù)了解CSE對

8、糖皮質(zhì)激素反應(yīng)的可能作用,明確其與HDAC2蛋白表達(dá)和功能的關(guān)系及可能的調(diào)控機(jī)制. 方法:用半定量RT-PCR檢測CSE刺激及10<'-6-10>M地塞米松干預(yù)對A549細(xì)胞IL-1β、IL-8、GM-CSF、MCP-1、MIP-1αRANTES mRNA表達(dá)水平的影響, 用間接免疫熒光法檢測不同干預(yù)刺激后A549細(xì)胞核內(nèi)組蛋白H4的乙?；?Western blot與化學(xué)比色法分別檢測HDAC2蛋白表達(dá)及其功能與CSE刺激、

9、地塞米松干預(yù)之間的關(guān)系.然后用實(shí)時(shí)定量熒光RT-PCR檢測明確相應(yīng)干預(yù)刺激對HDACs和HATS分子mRNA水平的影響,再用免疫共沉淀和Western. blot檢測HAAC2蛋白的酪氨酸硝基化、泛素化、SuMO化水平. 結(jié)果:CSE:刺激可以顯著上調(diào)IL-1β mRNA的表達(dá)(p<0.01)而對GM-CSF、IL-8、MCP-1、MIP-1α和RANTES mRNA表達(dá)的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均p>0.05).同時(shí),經(jīng)10<'-1

10、0>和10<'-8>地塞米松干預(yù),對CSE誘導(dǎo)的IL-1β mRNA表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(均p>0.05),10<,-6>6M地塞米松雖可顯著抑制CSE導(dǎo)的IL-1β mRNA的表達(dá)(p<0.05),但仍較對照組顯著增高(p>0.05).而CSE可以顯著抑制HDAC2蛋白的表達(dá)和活性(p<0.01),促進(jìn)組蛋白H4的乙酰化(p<0.01);但地塞米松對這種作用無顯著影響.進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn),無論單獨(dú)CSE刺激還是與地塞米松共干預(yù)對HDA

11、Cs的mRNA水平無顯著影響(Jp>0.05).但HDAC2蛋白的酪氨酸硝基化修飾和SuMO化修飾在CSE刺激后均發(fā)生顯著改變,前者升高,后者降低;而地塞米松對上述變化無明顯影響. 第三部分 SUMO-1修飾對HDAG 2功能的調(diào)控 目的:通過分子克隆和定點(diǎn)突變技術(shù)分析HDAC2蛋白SUMO化修飾的靶位,明確SUMO化對HDAC2功能的影響,初步揭示其中的潛在機(jī)制. 方法:用分子克隆技術(shù)構(gòu)建HDAC2-HA、SU

12、MO-1-FLAG、Ub-FLAG真核表達(dá)載體,用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建HDAC2-K462R真核表達(dá)載體.通過脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、免疫共沉淀、Western blot確定HDAC2的SUMO化修飾位點(diǎn),并檢測其活性變化.然后觀察HDAC2分子的SUMO化修飾對其與轉(zhuǎn)錄抑制輔助分子間相互作用的影響. 結(jié)果:成功構(gòu)建HDAC2-HA、SUMO-1-FLAG、Ub-FLAG和HDAC2-K462R真核表達(dá)載體.用HDAC2-HA、H

13、DAC2-K462R分別與SUMO-1-FLAG和Ub-FLAG共轉(zhuǎn)染,經(jīng)免疫共沉淀和 Western blot 檢測發(fā)現(xiàn),K462 是HDAC2分子的SUMO化靶位,SUMO化修飾對HDAC2蛋白的泛素化水平無顯著影響.在Hela細(xì)胞內(nèi),野生型HDAC2分子較SUMO化位點(diǎn)突變的HDAC2分子的活性顯著為高 (P<0.01).進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn),HDAC2蛋白的SUMO化修飾對它與mSin3A、Mi2、RbAp46N8、YY1分子的相互作

14、用無影響,但可以顯著降低與CoREST分子和HDAC1分子的相互作用. 結(jié)論： (1) 應(yīng)用恒流蠕動(dòng)裝置和高效液相色譜技術(shù)建立了一整套用于CSE制備、檢測定標(biāo)的方法.該方法具有較好的可重復(fù)性,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ). (2) CSE對人肺泡樣上皮細(xì)胞A549具有明顯的細(xì)胞毒作用,這種細(xì)胞毒作用幾乎不通過細(xì)胞凋亡途徑而由細(xì)胞壞死途徑介導(dǎo).其發(fā)生凋亡抑制的機(jī)制與上調(diào)凋亡抑制蛋白survivin和XIAP的表達(dá),抑制c

15、aspase9和caspase3的活化有關(guān).而前者的變化不受NFκB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控. (3) CSE可通過抑制A549細(xì)胞HDAC2分子的功能促進(jìn)組蛋白H4的乙猷化導(dǎo)致染色體重構(gòu),從而上調(diào)促炎因子IL-1β mRNA的表達(dá).糖皮質(zhì)激素不能顯著下調(diào)A549細(xì)胞促炎因子IL-1β mRNA的水平,表現(xiàn)為糖皮質(zhì)激素反應(yīng)的耐受.CSE介導(dǎo)的HDAC2功能下調(diào)和糖皮質(zhì)激素反應(yīng)減弱與CSE所致的HDAC2分子的兩種翻譯后修飾酪氨酸硝基化