肺炎克雷伯菌的毒力及其對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達的影響.pdf

1、目的:
　　眼內(nèi)炎是一種兇險的感染性致盲性眼后段疾病，常常造成嚴(yán)重的視力損害，內(nèi)源性眼內(nèi)炎是一種眼外感染后經(jīng)過血源性播散引起的兇險的感染性致盲性眼病，起病急驟，一旦病原菌侵入眼內(nèi)，迅速破壞眼內(nèi)組織，癥狀嚴(yán)重，雖然總體發(fā)病率低，但常造成嚴(yán)重的視力損害。細(xì)菌或真菌通過血液循環(huán)播散進入眼內(nèi)，引起脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜、玻璃體等眼內(nèi)組織的炎癥，其中細(xì)菌性眼內(nèi)炎居多，患病的危險因素主要包括糖尿病、免疫抑制、靜脈導(dǎo)管滯留、長期使用抗生素等。在臨床上，

2、眼科醫(yī)師掌握內(nèi)源性眼內(nèi)炎的病原分布及其致病特點對于疾病的診斷、治療及預(yù)后改善至關(guān)重要。內(nèi)源性眼內(nèi)炎致病菌譜近年來不斷發(fā)生著變化，新興出現(xiàn)高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae，hvKP)引起的眼內(nèi)炎，雖然最常見的癥狀亦是眼部腫脹、充血、視力模糊的突然發(fā)作，但其致病力明顯高于經(jīng)典肺炎克雷伯菌(classic Klebsiella pneumonia，cKP)，更難治愈，視力恢復(fù)較差，預(yù)后

3、不良，本研究將高毒力肺炎克雷伯菌與經(jīng)典肺炎克雷伯桿菌的特性進行比較，探討高毒力肺炎克雷伯菌毒力的相關(guān)特性及其對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞炎癥相關(guān)因子表達的影響。
　　方法:
　　收集8株高毒力肺炎克雷伯菌及8株經(jīng)典肺炎克雷伯菌，分成高毒力肺炎克雷伯菌組和經(jīng)典肺炎克雷伯菌組，首先分別檢測其高黏性特征、基因型特性、抗血清殺傷及抗巨噬細(xì)胞吞噬能力;再通過酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測細(xì)菌侵襲視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞后炎癥細(xì)胞因子的表達水平，具體如下:

4、r>　　1.細(xì)菌毒力檢測:
　　①粘液絲實驗:將受試菌接種于5％羊血瓊脂平板，于37℃孵育過夜，用細(xì)菌接種環(huán)向上挑起菌落，觀察記錄挑起的粘液絲長度;
　　②基因rmpA(regulator ofmucoid phenotype gene A)檢測:提取細(xì)菌基因組DNA，按25uL反應(yīng)體系和反應(yīng)流程進行PCR反應(yīng)擴增rmpA基因，檢測兩組細(xì)菌的基因表達情況;
　?、奂?xì)菌抗血清實驗:培養(yǎng)至對數(shù)后期的細(xì)菌107CFU/L，與

5、血清按比例1∶1混合培養(yǎng)2h，將混合培養(yǎng)液梯度稀釋檢測細(xì)菌的存活數(shù)量，計算細(xì)菌的存活率;
　?、芗?xì)菌抗吞噬細(xì)胞吞噬實驗:將培養(yǎng)至對數(shù)后期的細(xì)菌107CFU/L，按感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)100∶1比例與鼠源巨噬細(xì)胞Raw264.7混合孵育1h，檢測細(xì)菌存活數(shù)量，計算巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的存活率。
　　2.酶聯(lián)免疫吸附實驗:兩組細(xì)菌分別感染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞10h，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗檢

6、測上清液中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)及白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)兩種炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的水平。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)菌毒力檢測:
　?、俑叨玖Ψ窝卓死撞M在粘液絲實驗中均表現(xiàn)為陽性，而經(jīng)典肺炎克雷伯菌組均表現(xiàn)為陰性;
　?、趓mpA基因檢測結(jié)果顯示:高毒力肺炎克雷伯菌組均有rmpA基因543BP的表達，而經(jīng)典肺炎克

7、雷伯菌組沒有該基因的表達;
　?、奂?xì)菌抗血清實驗結(jié)果顯示:高毒力肺炎克雷伯菌組的存活率(18.2％)明顯高于經(jīng)典肺炎克雷伯菌組的存活率(5.3％)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.872，P＜0.05);
　?、芗?xì)菌抗巨噬細(xì)胞吞噬實驗結(jié)果顯示:巨噬細(xì)胞胞內(nèi)高毒力肺炎克雷伯菌組的細(xì)菌存活率(1.1％)明顯低于經(jīng)典肺炎克雷伯菌組(7.5％)，存在統(tǒng)計學(xué)差異(t=5.434，P＜0.05)。
　　2.酶聯(lián)免疫吸附實驗:高毒力肺炎

8、克雷伯菌組感染視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中MCP-1(1177pg/mL)、IL-6(119pg/mL)均高表達，而經(jīng)典肺炎克雷伯菌組MCP-1(670pg/mL)、IL-6(54pg/mL)則低表達，RPE細(xì)胞被高毒力肺炎克雷伯菌侵襲后分泌的MCP-1和IL-6的量分別是被經(jīng)典肺炎克雷伯菌侵襲后的1.76倍和2.20倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(tMCP-1=5.670，tIL-6=3.968，P均＜0.05)。
　　結(jié)論: