具有抗感染作用的陰道避孕栓的研制.pdf

1、背景與目的：近年來在現(xiàn)代避孕藥具的大家族中，屏障避孕因具有避孕和預(yù)防性傳播疾病(STD)的雙重功能，而為人們所重視。人們提倡的安全性行為運動，即堅持使用避孕套及減少性伴數(shù)量，在一定意義上可預(yù)防STD傳播，但文獻表明只有安全性行為的范圍十分廣泛時，才能在全球流行病學(xué)上顯示其結(jié)果。 STD和HIV由于傳播速度快，治療費用高，而且會增加其他STD和HIV病例傳播機會，日益獲得人們的重視，但目前的治療方法一般人難以負擔(dān)，而且易產(chǎn)生耐藥。

2、藥用植物在發(fā)達和不發(fā)達國家均已有較長的使用歷史，為許多在其它的藥物系統(tǒng)中頑固和難治的疾病提供了合理的治療方法。醫(yī)學(xué)植物具有如下優(yōu)點：副作用少，較少引起耐藥，患者耐受性好，相對便宜，趨向于恢復(fù)正常的生理功能和糾正潛在的病因，因此逐漸受歡迎。 我國具有豐富的中草藥資源，利用祖國醫(yī)學(xué)上千年的臨床實踐優(yōu)勢，運用現(xiàn)代科技，中草藥將可發(fā)展成為一種安全有效和經(jīng)濟的方法，作為目前STDs和AIDS癥狀治療的藥物的另一種選擇。 白色念珠菌

3、、陰道毛滴蟲、淋球菌、人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)是婦女泌尿生殖系統(tǒng)感染最常見的病原體。前期實驗已從多種中藥中篩選出6種有效抗白色念珠菌、淋球菌、滴蟲的中草藥復(fù)方，大鼠體內(nèi)實驗表明，此復(fù)方有一定的抗感染作用。 本試驗在前期實驗以及不降低甚至提高抗菌效果的基礎(chǔ)上，減少中藥成分，篩選出3～4種中草藥組成的復(fù)方，能有效抗白色念珠菌、淋球菌、滴蟲，并具有抗HPV的作用。以甘油明膠為基質(zhì)，采用壬苯醇醚-9

4、(nonoxynol-9，N-9)作為避孕成分，與篩選出的中草藥復(fù)方進行組合，研制一種避孕的同時具有抗感染作用的陰道栓劑，試圖提供一種可由婦女自行控制的避孕方法。 方法：在前期試驗的基礎(chǔ)上，篩選出抗淋球菌、白色念珠菌、陰道毛滴蟲、HPV的中草藥復(fù)方。 (1)淋球菌臨床標(biāo)本的體外分離培養(yǎng)；陰道毛滴蟲臨床標(biāo)本的分離培養(yǎng)；白色念珠菌標(biāo)準菌株的體外分離培養(yǎng)。 (2)采用水提醇沉法提取中草藥總成分，制備各中草藥濃縮液。

5、 (3)以抑菌圈為指標(biāo)，采用紙片法進行中草藥抑淋球菌及白色念珠菌實驗；以MIC值為指標(biāo)，采用平板稀釋法評價中草藥抗淋球菌及白色念珠菌效力；以滴蟲死亡率為指標(biāo)，評價中草藥抗陰道毛滴蟲效力；采用PCR技術(shù)檢測離體尖銳濕疣組織中HPV-DNA經(jīng)中藥作用后的變化。 (4)確定中草藥復(fù)方后，應(yīng)用均勻設(shè)計，篩選出效果最好的中草藥復(fù)方配方。 2.陰道制劑的制備及質(zhì)量控制 (1)以甘油明膠(甘油：明膠：水為7：2：1)為基質(zhì)

6、，以中草藥復(fù)方與壬苯醇醚-9(nonoxynol-9，N-9)為活性成分，制備局部用栓劑。行栓劑質(zhì)量評價。 (2)采用薄層層析法(thin-layerchromatography,TLC)，用硅膠G薄板，對黃連、虎杖進行定性鑒別。 (3)以鹽酸小檗堿為質(zhì)量控制指標(biāo)，采用薄層-紫外分光光度法進行含量測定。通過建立標(biāo)準曲線，加樣回收率測定，穩(wěn)定性實驗確立自制栓劑的質(zhì)量標(biāo)準。 (4)以壬苯醇醚-9為質(zhì)量控制指標(biāo)，建立標(biāo)

7、準曲線，測定樣品中壬苯醇醚-9含量。 3.自制栓劑的體外抗感染與殺精作用 (1)以MIC值為指標(biāo)，采用平板稀釋法評價栓劑抗淋球菌及白色念珠菌效力；以滴蟲死亡率為指標(biāo)，評價栓劑抗陰道毛滴蟲效力；采用PCR技術(shù)檢測離體尖銳濕疣組織中HPV-DNA經(jīng)栓劑作用后的變化。 (2)采集新鮮人精液(精子總數(shù)和精子活動度測定符合標(biāo)準者)，采用改良的Sander-Cramer方法，記錄精子存活情況，以N-9栓為陽性對照，以評價自制

8、栓劑的殺精效果。 4.自制栓劑對大鼠的陰道刺激試驗 大鼠分組，陰道連續(xù)上藥10d后進行解剖，肉眼觀察后制備石蠟切片，常規(guī)染色進行組織病理學(xué)檢查并評分。 結(jié)果： 1.病原體分離培養(yǎng)和抗病原體中草藥篩選 (1)病原體分離鑒定：淋球菌呈G-腎形雙球菌，氧化酶試驗陽性，分解葡萄糖；白色念球菌為G+酵母樣菌，沙氏培養(yǎng)基上形成典型菌落；陰道毛滴蟲濕片鏡檢：顯微鏡(1000倍)下可見到比白細胞大，運動活潑、梨形

9、或水滴狀，無色透明的蟲體，有鞭毛和波動膜。 (2)抗病原體中草藥篩選：抗淋球菌效果以黃連+虎杖、黃連為最佳，其抗淋球菌的最小抑菌濃度(minimuminhibitoryconcentration，MIC)為12.5mg/ml。抗白色念珠菌效果效果仍以黃連+虎杖為最佳，其抗白色念珠菌的MIC值為25mg/ml。白頭翁抗陰道毛滴蟲的效果最好，1：1濃度下作用2h滴蟲死亡率為94.3％，優(yōu)于仙鶴草及白頭翁+仙鶴草。黃連、虎杖、白頭翁、

10、黃連+虎杖+白頭翁作用于離體尖銳濕疣組織混懸液有抗HPV病毒的作用。 (3)選定黃連、虎杖、白頭翁為中藥復(fù)方，同上述抗感染試驗方法，篩選出黃連：虎杖：白頭翁=3：1：2時抑菌效果最佳。 2.制劑的制備及質(zhì)量控制 (1)以甘油明膠(甘油：明膠：水為7：2：1)為基質(zhì)，以復(fù)方中藥及N-9為活性成分，制備局部用栓劑。自制栓劑質(zhì)量評價符合規(guī)定。 (2)分別以各自的對照品和藥材相比照，檢出黃連、虎杖兩味藥材。

11、 (3)紫外分光光度計進行掃描，得出在380～700nm，供試品、鹽酸小檗堿對照品在430nm有最大吸收。標(biāo)準曲線在0.25μg～1.25μg之間有良好的線性關(guān)系。測得鹽酸小檗堿含量17.17mg/g，加樣回收率為97.63％，RSD為1.88％。 (4)壬苯醇醚-9標(biāo)準曲線在50μg～500μg之間有良好的線性關(guān)系。 3.自制栓劑的體外抗感染與殺精作用 (1)自制栓劑有明顯的體外抗淋球菌、白色念珠菌、陰道毛滴

12、蟲及對離體尖銳濕疣組織中HPV-DNA有遏制作用。 (2)自制陰道栓的殺精效果確切，其最低有效殺精濃度為0.1953mg/ml，與N-9栓相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。 4.自制栓劑對大鼠的陰道刺激試驗 病理切片，成品栓組大鼠陰道粘膜病變總分值為6.75，小于8分，按照Eckstein評價標(biāo)準，在可接受范圍內(nèi)；與N-9栓組病變分值(6.25)之間無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論： 1.黃連、虎杖及組方

13、有顯著的抗白色念珠菌和淋球菌作用。白頭翁抗陰道毛滴蟲的作用最強，三者均對離體尖銳濕疣組織有一定破壞作用。選取此3味藥材組成復(fù)方，經(jīng)均勻設(shè)計，篩選出黃連：虎杖：白頭翁為3：1：2時抑菌效果最佳。 2.栓劑外觀、質(zhì)量差異檢查及融變時限檢查均符合規(guī)定。實驗采用薄層掃描法測定栓劑中鹽酸小檗堿的含量，無其它成分干擾，操作簡便，符合制劑質(zhì)量控制范圍的要求，回收率和重現(xiàn)性均較好。并采用紫外分光光度法測定栓劑中N-9含量，符合制劑質(zhì)量要求的范圍