抗感染金屬植入物的設計制備及其抗感染效果研究.pdf

1、感染仍然是骨科植入物的嚴重并發(fā)癥之一。植入體內(nèi)的金屬異物是導致此類感染發(fā)生的危險因素,所引發(fā)的一系列體內(nèi)反應包括巨噬細胞功能的減弱,局部免疫系統(tǒng)的鈍化等都為病原體的增殖創(chuàng)造了便利的條件。此外,植入物表面吸附的蛋白還能促進細菌黏附到植入物表面引發(fā)感染。過去我們大多關(guān)注對環(huán)境和個人污染的清除及圍手術(shù)期全身抗生素的應用,而新的策略則是針對該類感染發(fā)病的特殊機制通過植入物表面修飾改性來降低感染的風險。
　　全身用藥時,可能會因患處血液循環(huán)

2、受損和周圍瘢痕組織的影響導致病灶處的抗生素濃度無法達到有效水平,從而影響金屬材料植入后感染防治效果,還會帶來全身的毒副作用。研究證實,細菌一旦被隔離在無血運的骨組織中,抗生素的全身治療很難在局部達到滿意的藥物濃度。而且,一旦病原體附著于骨或其它生物材料表面,就會產(chǎn)生代謝和表型的改變,使病原體能夠?qū)股禺a(chǎn)生抵抗和逃脫免疫監(jiān)督,局部較低的抗生素濃度反而有可能會成為細菌耐藥性選擇的動力。為了改善骨感染的治療效果,抗生素的局部給藥方法得到研究

3、與開發(fā)。其中,抗生素緩釋系統(tǒng)以其具有的藥物持續(xù)性和可調(diào)控性釋放特點而受到青睞。
　　本項目組在前期低彈β鈦合金和藥物控釋研究的基礎(chǔ)上,對鈦合金表面進行規(guī)則微形態(tài)改性,然后進行多巴胺涂層修飾并以其為媒介將慶大霉素明膠微球緩釋系統(tǒng)成功構(gòu)建于鈦合金表面,通過前期的表面表征分析,藥物釋放實驗和體外抑菌實驗等證實該金屬表面抗生素緩釋系統(tǒng)具有微球結(jié)合牢固,藥物釋放持續(xù)可控,體外抑菌作用明顯等優(yōu)點。本研究主要在前期工作的基礎(chǔ)上繼續(xù)探索該金屬表面

4、抗感染緩釋系統(tǒng)的體內(nèi)外生物相容性及動物感染狀況下的材料植入對已發(fā)感染的控制效果。
　　目的
　　在前期低彈β鈦合金表面抗生素緩釋系統(tǒng)成功構(gòu)建的基礎(chǔ)上,進一步通過體外細胞實驗和熒光染色研究多巴胺涂層修飾對成骨細胞黏附的影響及其生物相容性,通過小鼠肌袋植入實驗觀察復合材料的體內(nèi)生物相容性,建立兔脛骨骨髓炎模型,并最后通過兔脛骨骨髓炎模型的體內(nèi)植入,研究鈦合金表面抗生素緩釋系統(tǒng)對于感染的控制作用,從而為抗感染金屬植入物的研制和開發(fā)

5、奠定理論和實驗基礎(chǔ)。
　　方法
　　1.鈦合金表面多巴胺修飾的細胞相容性檢查:為探索多聚多巴胺涂層的生物相容性,將家兔來源的骨髓基質(zhì)干細胞接種于多聚多巴胺涂層修飾后的鈦合金表面,然后分別采用 MTT定量計算和激光共聚焦顯微鏡定性觀察的手段,分析材料表面細胞的粘附、增殖情況,并與未涂層材料作對比,觀察涂層修飾后材料生物相容性的變化。然后鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)溶液,分別對活細胞和死細胞進行熒光染

6、色,觀察細胞生長存活情況。鈣黃綠素可顯示胞漿,PI顯示死細胞的細胞核。采用激光共聚焦顯微鏡對活細胞生長形態(tài)進行觀察。胞漿結(jié)構(gòu)完整的綠色代表正常細胞,胞漿碎片狀結(jié)構(gòu)不完整、細胞核紅染的代表晚期凋亡細胞。
　　2.復合材料的體內(nèi)生物相容性檢測:將30只Balb/c小鼠隨機分為3組,A組植入復合抗感染材料,B組植入單純鈦合金材料,C組采取切開縫合處理。術(shù)后1、2、3、6周取材,采集外周血用流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群分類CD4和CD8的

7、百分比變化情況并進行組織學觀察,評估復合抗感染材料在體內(nèi)的生物相容性。
　　3.骨科金屬植入物感染動物模型構(gòu)建方法:(1)將健康家兔48只隨機分為5組,實驗組A、B、C、D組每組10只,對照組8只。實驗組動物分別在脛骨近端髓腔內(nèi)注入濃度分別為1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108CFU/ml的金黃色葡萄球菌懸液1ml,并在脛骨髓腔內(nèi)置入長4.0cm,直徑0.25cm鈦合金棒一根;對照組置入相同規(guī)格的鈦合金棒

8、后注入生理鹽水1ml;(2)分別通過大體觀察、體溫測量、X線檢查、細菌學培養(yǎng)、組織學觀察、感染率和死亡率評價模型制備效果,篩選建模所需最佳細菌濃度。
　　4.抗感染金屬植入物對家兔感染模型感染控制作用評價:所有新西蘭大白兔稱量體重、測量體溫后隨機編號,均勻地分為2個實驗組(A組和B組),兔左側(cè)脛骨為實驗側(cè),用來注入菌液建立感染后行材料植入。A組為實驗組,植入復合抗生素的金屬材料,B組為對照組,植入未復合抗生素的金屬材料,取材時間點

9、為術(shù)后2周、4周和8周。所有動物行脛骨側(cè)位X線檢測,各時間點取材后進行大體觀察,細菌培養(yǎng)和HE染色組織學觀察。
　　結(jié)果
　　1.鈦合金表面多巴胺修飾的細胞相容性檢查: MTT法測定兩組材料各時間點的吸光值后,采用Wilcoxon秩和檢驗進行統(tǒng)計分析,分析結(jié)果顯示,第1天兩組之間材料表面細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義。第3,5,7,9天,未涂層組材料表面數(shù)量略高于涂層組,組間差異有統(tǒng)計學意義((Pa<0.01,Pb<0.05),表

10、明多聚多巴胺涂層對材料表面的細胞增殖有負面影響,但影響程度較輕。兩組材料上鈣黃綠素綠染的細胞證實,活細胞生長狀況良好,涂層組凋亡細胞多于未涂層組,實驗結(jié)果與 MTT測定結(jié)果相符。
　　2.復合材料的體內(nèi)生物相容性檢測:流式細胞測定結(jié)果的方差分析顯示,術(shù)后第一周,涂層材料組的CD4/CD8比值同切開縫合組相比無統(tǒng)計學差異,而未涂層材料組的CD4/CD8比值顯著低于其他兩組(P<0.01),第二周和第三周的測定結(jié)果與第一周結(jié)果類似。第

11、六周時,三組之間的CD4/CD8比值均無顯著差異。組織學觀察結(jié)果顯示,1、2、3、6W時,未涂層組與涂層組相比,纖維組織增生明顯,炎細胞浸潤較多。涂層組隨時間增長,纖維增生和炎細胞浸潤大大減少,未涂層組6W時依然可見明顯的纖維組織增生和炎癥細胞浸潤。
　　3.感染動物模型制備結(jié)果:模型動物在最初兩周局部軟組織出現(xiàn)腫脹,體溫明顯升高隨后降到正常。術(shù)后4周影像學顯示實驗組動物患肢出現(xiàn)骨膜反應、骨壞死及髓腔纖維化等表現(xiàn),細菌培養(yǎng)顯示實驗

12、組中感染程度隨接種細菌濃度增高而加劇, C、D兩組感染率為100％,接種1.0×107(CFU)/ml濃度細菌的C組具有最高的成活率為80%,D組具有最高的死亡率為70%。術(shù)后4周病理學觀察到骨纖維化、骨壞死等典型感染表現(xiàn)。
　　4.抗感染金屬植入物對家兔感染模型的感染控制作用評價:對實驗動物的術(shù)后X線隨訪發(fā)現(xiàn),2周時實驗組(A組)與對照組(B組)均有骨膜反應表現(xiàn);4周和8周時對照組的骨膜反應加重同時有骨質(zhì)溶解破壞和死骨出現(xiàn)。細菌

13、培養(yǎng)結(jié)果顯示,實驗組骨組織和植入物培養(yǎng)結(jié)果一致,培養(yǎng)板上未培養(yǎng)出菌落,表明實驗組復合材料在家兔感染模型上發(fā)揮了明顯的殺菌、抑菌作用。而對照組的培養(yǎng)板上幾乎長滿了白色菌落,表明對照組骨組織和植入物表面存在大量細菌,兩組差異明顯。組織學觀察結(jié)果顯示實驗組脛骨組織學切片鏡下,髓腔脂肪細胞排列規(guī)則,結(jié)構(gòu)完整,造血細胞充滿脂肪細胞間隙,脛骨皮質(zhì)層結(jié)構(gòu)完整,排列緊密,細胞結(jié)構(gòu)完整,可見明顯的細胞核存在。對照組為復合空白微球材料組,動物脛骨髓腔組織病

14、理學可見髓腔梗死及纖維化,漿細胞和單核細胞積聚髓腔,正常的空泡狀脂肪細胞結(jié)構(gòu)消失而被大量膿液占據(jù),髓腔側(cè)及皮質(zhì)骨內(nèi)可見壞死骨片,并且隨時間延長,對照組壞死骨片范圍擴大。
　　結(jié)論
　　1.鈦合金表面多聚多巴胺涂層修飾在體外實驗中會對細胞黏附造成輕微的負面影響,鈣黃綠素染色發(fā)現(xiàn)多巴胺涂層無明顯的生物毒性。明膠微球的復合使材料在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出良好的生物相容性。
　　2.成功構(gòu)建出骨科金屬植入物并發(fā)感染的動物模型,該模型制備