以DNA為靶點(diǎn)的小分子配體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主性死亡過程，可以維持機(jī)體自身穩(wěn)定及正常生理功能，因此具有重大的生物學(xué)意義。細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中都發(fā)揮著重要作用，研究表明，多種化療藥物可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生抗癌效果。另外，隨著對DNA結(jié)構(gòu)和功能研究的不斷深入，人們已經(jīng)認(rèn)識到體內(nèi)的DNA可以存在多種不同的二級結(jié)構(gòu)形式，如雙螺旋和G-四鏈體等，這些不同結(jié)構(gòu)的DNA之間的相互轉(zhuǎn)化可以影響細(xì)胞的各種生理事件。因此以DNA為靶點(diǎn)的小分子配體研究

2、，尤其是配體分子與DNA結(jié)構(gòu)的相互作用機(jī)制研究，在抗癌藥物的研究中受到了廣泛的關(guān)注和重視。綜合考慮以上兩方面因素，研究以不同形式DNA為靶點(diǎn)的小分子化合物的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，可以為抗腫瘤藥物開發(fā)提供新的理論依據(jù)和研究思路。
　　 以雙螺旋DNA和G-四鏈體DNA為靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)室分別設(shè)計(jì)并合成了大黃素衍生物和吲哚并喹啉衍生物，且證明這兩類衍生物能選擇性的與雙螺旋DNA或G-四鏈體DNA識別和作用，并顯示出良好的抑制腫瘤細(xì)胞生長增殖

3、的能力。本論文是在上述研究基礎(chǔ)上，更深入的論證這兩類衍生物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力、構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)制。本論文的主要內(nèi)容包括：
　　 1.細(xì)胞凋亡概述。文中介紹了細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化特征，細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)途徑，Bcl-2蛋白家族和caspase蛋白酶家族對細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程，細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療中的作用及相關(guān)的研究和檢測方法等。
　　 2.以DNA為靶點(diǎn)的小分子配體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展。概述了DNA結(jié)構(gòu)多

4、態(tài)性的形式，即雙螺旋DNA、三螺旋DNA和G-四鏈體DNA三種不同結(jié)構(gòu)形式DNA的特點(diǎn)，并分別討論以雙螺旋DNA和G-四鏈體DNA為靶點(diǎn)的小分子配體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。其中，重點(diǎn)介紹了G-四鏈體DNA的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能(包括抗凋亡基因bcl-2啟動(dòng)子區(qū)域的G-四鏈體)，及小分子配體與G-四鏈體相互作用的研究方法。
　　 3.以雙螺旋DNA為靶點(diǎn)的大黃素衍生物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用研究。以本實(shí)驗(yàn)室合成的七種具有不同側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的蒽吡唑類大黃素

5、衍生物為研究對象，進(jìn)行了MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、Hoechst染色、DNA ladder檢測、caspase-3活性檢測和PARP降解檢測等實(shí)驗(yàn)，證明了此類衍生物具有誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2產(chǎn)生凋亡的能力，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡具有caspase酶依賴性。進(jìn)一步比較衍生物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的構(gòu)效關(guān)系及其與雙螺旋DNA的結(jié)合能力和模式，提出了此類衍生物主要通過與雙螺旋DNA相互作用誘發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制。
　　 4.以G-四鏈體DNA為靶點(diǎn)的吲哚并

6、喹啉衍生物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用研究。構(gòu)建了含有bcl-2啟動(dòng)子富G序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，并對其中的鳥嘌呤序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，首次證明了在人自血病細(xì)胞HL-60中bcl-2啟動(dòng)子區(qū)域G-四鏈體結(jié)構(gòu)的存在對基因轉(zhuǎn)錄具有顯著抑制作用。同時(shí)，以本實(shí)驗(yàn)室合成的不同母環(huán)及不同側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的三種吲哚并喹啉衍生物為研究對象，應(yīng)用EMSA、CD光譜、SPR、FRET及PCR中止等多種體外實(shí)驗(yàn)方法，證明了衍生物具有良好的結(jié)合和穩(wěn)定抗凋亡基因bcl-2啟動(dòng)子區(qū)域

7、G-四鏈體DNA的能力。且通過誘導(dǎo)和穩(wěn)定bcl-2啟動(dòng)子DNA形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，吲哚并喹啉衍生物可以進(jìn)一步抑制bcl-2基因啟動(dòng)子的活性。最后，利用RT-PCR，熒光定量PCR、western blot和流式細(xì)胞儀等細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證明了衍生物抑制bcl-2基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的作用及誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的能力?？偨Y(jié)衍生物與bel-2基因G-四鏈體的作用、抑制基因轉(zhuǎn)錄翻譯及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力之間的構(gòu)效關(guān)系可知，側(cè)鏈末端為叔胺基衍生物的作用強(qiáng)于