Cu2+誘導小膠質細胞激活作用及其分子機制研究.pdf

1、小膠質細胞激活誘發(fā)的神經炎癥及神經元損傷在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis,MS)等神經退行性疾病病理生理機制中發(fā)揮了重要作用。過渡金屬離子,特別是具有氧化還原活性的Cu2+,對于維持中樞神經系統(tǒng)的生理生化功能起著重要的作用。腦內Cu2+濃度過高或過低均可能導致神經元損傷。有證據(jù)顯示,神經退行性疾病患

2、者或者動物模型腦內細胞內外Cu2+分布不平衡,細胞外Cu2+濃度升高,遠遠超出正常生理濃度,而細胞內Cu2+濃度降低;過高濃度的細胞外Cu2+可直接損傷神經元,但是否能夠直接激活與神經元密切接觸的小膠質細胞,尚無文獻報道?；诖?本課題擬對Cu2+直接作用于小膠質細胞后,其功能狀態(tài)的改變及其分子機制進行較深入探討。
　　本研究采用原代培養(yǎng)的大鼠小膠質細胞以及小鼠BV-2細胞株,應用ELISA、Greiss法和WST-1試劑測定小膠

3、質細胞培養(yǎng)上清中的腫瘤壞死因子-α( Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、一氧化氮(nitric oxide,NO)以及超氧化物(superoxide)含量;應用Amplex Red試劑測定小膠質細胞培養(yǎng)上清或分離線粒體組織中過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)的含量;應用能夠特異性檢測活細胞線粒體內活性氧(reactive oxygen species,ROS)的熒光探針,檢測線粒體內RO

4、S含量;應用Western blot檢測誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、IκB-α表達以及Akt、胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase1/2, ERK1/2)磷酸化水平。
　　研究結果顯示:1)Cu2+處理12 h后,小膠質細胞呈現(xiàn)明顯的激活狀態(tài);Cu2+(5-50μM)能夠劑量依賴性地誘導小膠質細胞釋放TNF-

5、α和NO,并誘導iNOS表達;2)IκB-α和IKK-2阻斷劑能夠顯著抑制Cu2+誘導的TNF-α產生;Cu2+作用12h后小膠質細胞內IкB-α表達明顯下降(為NF-кB激活標志之一),提示Cu2+激活小膠質細胞的作用為NF-кB依賴性;3)在激活小膠質細胞劑量下,Cu2+對原代海馬神經元沒有明顯毒性,但其處理小膠質細胞后獲得的條件培養(yǎng)液能夠明顯降低神經元活力;4)Cu2+處理后小膠質細胞培養(yǎng)上清中H2O2含量明顯增加(該作用在Cu2

6、+處理后5 min即可產生);煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(NADPH oxidase,NOX)阻斷劑Apocynin(100μM)和Diphenyleneidonium(DPI,10μM)預處理對該作用沒有明顯影響;Cu2+處理后小膠質細胞培養(yǎng)上清中超氧化物水平沒有明顯變化;Cu2+能夠促進分離的線粒體組織釋放H2O2(該作用同樣在Cu

7、2+處理后5 min即可產生),以及活細胞線粒體內ROS產生。提示ROS(以H2O2的形式)可能參與了Cu2+誘發(fā)小膠質細胞激活作用,而且該H2O2的來源可能為線粒體,而非NOX;5) NOX阻斷劑Apocynin(100μM)和DPI(10μM)預處理不影響Cu2+誘導的TNF-α釋放,進一步提示NOX可能不參與Cu2+激活小膠質細胞作用;6)磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)阻斷劑LY2

8、94002(25μM)和ERK1/2阻斷劑U0126(10μM)預處理能夠顯著抑制Cu2+誘導的TNF-α釋放,而蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)阻斷劑對此沒有阻斷作用;Western blot結果顯示Cu2+作用于小膠質細胞后,ERK1/2和Akt磷酸化水平明顯升高。提示PI3K/Akt和ERK1/2信號均參與了Cu2+激活小膠質細胞作用;7)應用LY294002預處理后,再應用Cu2+處理小膠質細胞,ERK1/

9、2磷酸化水平不再升高,提示在功能上PI3K/Akt信號可能位于ERK1/2信號上游;8)LY294002和U0126均能夠抑制Cu2+誘導的H2O2釋放,提示PI3K/Akt-ERK1/2信號通路可能介導了H2O2的產生。
　　綜上,本研究通過一系列細胞學實驗初步證實了:1)亞神經毒性劑量下Cu2+能夠直接激活小膠質細胞,誘導NF-кB活化,促進TNF-α和NO等炎癥因子的產生,并由此導致間接神經元毒性;該作用可能不依賴于NOX。