鉛誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子COX-2表達(dá)的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.用蛋白免疫印跡研究鉛暴露條件下，幾種常用的腦細(xì)胞系炎性因子環(huán)氧化酶
　　2(COX-2)的變化情況。
　　2.闡明鉛誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞COX-2表達(dá)的分子機(jī)制。
　　3.揭示鉛誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞COX-2表達(dá)介導(dǎo)的生物學(xué)功能，為指導(dǎo)臨床鉛對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷等相關(guān)疾病用藥提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.對(duì)BV-2、C6、PC12和RBE4細(xì)胞株進(jìn)行不同濃度及不同時(shí)間的醋酸鉛處理，采用Western

2、blot（蛋白免疫印跡）來檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)變化。
　　2.提取細(xì)胞的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行PCR檢測cox-2信使RNA的表達(dá)變化情況。
　　3.向C6細(xì)胞轉(zhuǎn)染cox-2啟動(dòng)子報(bào)告基因（cox-2 promoter luciferse），得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后，用醋酸鉛刺激該細(xì)胞，并檢測其熒光素酶值的變化情況，來反映cox-2啟動(dòng)子的活性。
　　4.向C6細(xì)胞轉(zhuǎn)染帶有熒光素酶的轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒(NFAT lucifers

3、e、NFκ Bluciferse、AP-1 luciferse)，并得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。用醋酸鉛對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株進(jìn)行不同濃度和不同時(shí)間的刺激，采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測相對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子的活性變化情況。
　　5.向C6細(xì)胞轉(zhuǎn)染導(dǎo)致NFAT功能突變的質(zhì)粒（cox-2 luxciferse NFAT mut），以確定在NFAT功能受抑制后在不同時(shí)間及不同濃度鉛處理之下，相對(duì)應(yīng)的熒光素酶活性變化情況，以檢測NFAT在鉛誘導(dǎo)cox-2轉(zhuǎn)錄

4、活性過程中所起的作用。
　　結(jié)果:
　　1.用不同濃度劑量依賴及不同時(shí)間依賴的鉛刺激BV-2、C6、PC12和RBE4細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)COX-2在膠質(zhì)細(xì)胞BV-2和膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6中表達(dá)升高，但在RBE4和類神經(jīng)元細(xì)胞PC12中表達(dá)并不明顯。
　　2.PCR的結(jié)果表明:25μM的鉛處理24小時(shí)即可使BV-2和C6細(xì)胞cox-2信使RNA有明顯的誘導(dǎo)表達(dá)，且隨著鉛刺激濃度增加cox-2信使RNA表達(dá)增加;在不同時(shí)間點(diǎn)用50μM

5、的鉛分別刺激BV-2和C6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著鉛刺激的時(shí)間增加，cox-2信使RNA表達(dá)較陰性對(duì)照有明顯增加，并且呈依次增加的趨勢。
　　3.向C6細(xì)胞轉(zhuǎn)染cox-2啟動(dòng)子報(bào)告基因，并對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株進(jìn)行鉛刺激。結(jié)果顯示，40μM鉛處理12小時(shí)后cox-2啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性較陰性對(duì)照增加1.48±0.08倍，24小時(shí)為1.72±0.13，。說明鉛可以增加cox-2啟動(dòng)子的活性，從而增強(qiáng)cox-2的轉(zhuǎn)錄。
　　4.用蛋白免疫印跡的方法

6、和熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測了部分與cox-2相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)鉛誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞cox-2基因的表達(dá)是依賴NFAT轉(zhuǎn)錄因子的。隨后對(duì)NFAT進(jìn)行功能性突變，發(fā)現(xiàn)抑制NFAT活性后，cox-2啟動(dòng)子的活性明顯下降。
　　結(jié)論:
　　本課題通過鉛來刺激不同的腦細(xì)胞系，蛋白免疫印跡的結(jié)果顯示鉛可以誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子COX-2表達(dá);在隨后進(jìn)一步的研究中，我們發(fā)現(xiàn)鉛可以使膠質(zhì)細(xì)胞的cox-2信使RNA表達(dá)水平也升高;更進(jìn)一步的研究