核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ2誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化及其分子機(jī)制研究.pdf

1、上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ2誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化及其分子機(jī)制研究姓名：左祥生申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)內(nèi)分泌及代謝病指導(dǎo)教師：羅敏2001.3.1上海第二 醫(yī)科大學(xué)博士學(xué) 位論文供條 件 。 我 們 從 重 組 質(zhì) 粒p c D N A 3 / m P P A R y 2 中 雙 酶 切F m P P A R y 2 基 因 序 列 ， 亞 克隆 入 逆轉(zhuǎn) 錄 病毒 載體p G C E N中 構(gòu) 建 重 組 逆

2、轉(zhuǎn) 錄 病毒 載體p G C E N / m P P A R 刀。 用陽離 子 脂 質(zhì) 體L i p o f e c t A M I N E 介導(dǎo) 重 組 逆轉(zhuǎn) 錄 病 毒 載 體p G C E N / m P P A R y 2 及p G C E N轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系 P A 3 1 7 細(xì)胞，并用 G 4 1 8 進(jìn)行抗性克隆篩選， 在 G 4 1 8 存在條件下穩(wěn)定傳3 - 4 代， 然后在無G 4 1 8 條件下生長4 8 h ，

3、細(xì)胞達(dá) 8 0 % 融合， 取其 1 = 清 1 : 1 0 0稀釋 后感染 N I H 3 T 3細(xì)胞， 并加 入 p o l y b r e n e 8 u g / m l ， 培 養(yǎng) 4 8 h后， 加 入 G 4 1 83 0 0 u g / m l o N I H 3 T 3細(xì)胞抗性克隆形 成后， 對(duì)抗性克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)， 計(jì)算病毒滴 度，病毒滴度=克隆數(shù)x 病毒液稀釋倍數(shù)。 待其抗性克隆生長融合成片， 胰酶消化， 在G 4

4、 1 8 存在條件下 穩(wěn) 定傳代3 - 4 代， 即 為p G C E N / m P P A R y 2 - N I H 3 T 3 細(xì)胞及p G C E N- N I H 3 T 3 細(xì)胞。 免 疫熒光染 色及免疫印 跡 方法來鑒定m P P A R y 2 基 因在N I H 3 T 3 細(xì)胞中 表 達(dá) 情 況。 取p G C E N / m P P A R y 2 - N I H 3 T 3 和p G C E N - N I

5、 H 3 T 3 細(xì) 胞 接種 于1 2孔 板中， 在 含1 0 % 胎牛 血 清 和S u g / m l 胰島 素的D M E M培 養(yǎng) 基中 生 長至1 0 0 融 合，再在上述培養(yǎng)液中加入 l u m的地塞米松培養(yǎng)4 8 h ， 最后在D M E M培養(yǎng)液 ( 含 1 0 %胎牛 血 清 和 5 u g / m l 胰島 素) 中 加入 1 0 0 p m的P P A R y 激活 物 E T Y A ， 繼續(xù) 培 養(yǎng) 1 0

6、天， 其間 每兩天換一次培養(yǎng)液。 用甲 醛鈣固 定細(xì)胞后，用油紅 O染色細(xì)胞內(nèi) 脂質(zhì)。以 經(jīng)上 述同 樣 分 化 過 程的p G C E N - N I H 3 T 3 細(xì)胞 作 陰 性 對(duì)照 細(xì)胞。 同 時(shí) 用R T - P C R鑒定誘導(dǎo) 分化的 脂肪細(xì) 胞中 特異 性基因A P 2 和 L e p t i n 表 達(dá)情況。 結(jié)果 表明 我 們成功 構(gòu) 建了 重 組 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒 載 體 p G C E N / m P P A

7、 R y 2 0 通過 對(duì) 逆 轉(zhuǎn) 錄 表達(dá) 載 體 進(jìn) 行 包裝， 獲 得了 含 較高 滴 度 重 組 逆 轉(zhuǎn) 錄 病 毒p G C E N / m P P A : E 2 y 2 及p G C E N病 毒 的 培 養(yǎng) 土清， 病毒滴度分別為5 x 1 0 ^ C F U / m l 和6 x 1 0 5 C F U / m l 。 用逆轉(zhuǎn)錄病毒上清感染N I H 3 T 3細(xì) 胞后， 免 疫 熒光 染色 可見， p G

8、C E N / m P P A R y 2 - N I H 3 T 3細(xì)胞 核呈 黃綠色 改 變，為m P P A R y 2 表 達(dá)陽 性 細(xì) 胞， 而p G C E N - N I H 3 T 3 細(xì) 胞 核 未 見 上 述 改 變。 進(jìn)一 步 用油 紅O 及H E 染色， 發(fā) 現(xiàn)經(jīng)上 述分 化1 0 天 后的p G C E N / m P P A R y 2 - N I H 3 T 3 細(xì)胞中 ，部 分細(xì)胞胞 漿含有 較多 被

9、染 成紅色的中 性脂肪， 細(xì) 胞形 態(tài)由 N I H 3 T 3 的 梭形變成圓 形 ，且細(xì)胞核移向 細(xì)胞一側(cè)， 與體內(nèi) 成熟脂肪細(xì)胞形態(tài)相似，這些細(xì)胞被稱之為誘導(dǎo)分化的 脂肪細(xì)胞。 p G C E N - N I H 3 T 3細(xì)胞同 樣經(jīng)上 述分 化過程， 未見 上述改 變， 被稱之為陰性對(duì)照細(xì)胞。R T - P C R 結(jié)果提示誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞不僅在細(xì)胞形態(tài)上發(fā)生上述特異性改變， 而且表達(dá)脂肪細(xì)胞特異性基因A P 2 和L e