轉(zhuǎn)錄因子TCF-1調(diào)控淋巴濾泡輔助T細(xì)胞的分化和功能的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　B細(xì)胞活化后、歷經(jīng)克隆增殖、體細(xì)胞高頻突變、抗體類別轉(zhuǎn)化等過程最終分化成為漿細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞，這些過程都需要CD4+T細(xì)胞的輔助?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為，這些輔助B細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞亞群，是一群因高表達(dá)CXCR5而在淋巴濾泡逗留的輔助T細(xì)胞，即淋巴濾泡輔助T細(xì)胞(Follicular Helper T cells，TFH)。TFH細(xì)胞的失調(diào)與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，包括自身免疫性疾病、免疫缺陷、感染性疾病、腫瘤等。因此，研究TF

2、H細(xì)胞的分化和功能，將為疫苗和佐劑的設(shè)計(jì)、疫苗使用的優(yōu)化以及治療TFH細(xì)胞失調(diào)引起的各種疾病提供更好的方向、靶點(diǎn)和策略，具有重要的科學(xué)意義和實(shí)用價(jià)值。
　　在LCMV病毒急性感染模型中，CD4+T細(xì)胞分化成為TFH細(xì)胞和TH1細(xì)胞，并分別發(fā)揮了輔助B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的作用。活化的CD4+T細(xì)胞是如何分化成為這兩種表型、功能完全不同的細(xì)胞亞群，是獲得性免疫領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。TFH細(xì)胞分化是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜過程。在一些關(guān)鍵分

3、子的調(diào)控下，CD4+T細(xì)胞開啟完全不同的基因表達(dá)模式，使得細(xì)胞向著不同的分化終點(diǎn)前進(jìn)。其中，轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6及Blimp1被認(rèn)為是決定CD4+T細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵分子。
　　Bcl-6是TFH細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，而Blimp1是與Bcl-6相互拮抗的分子。它們之間的平衡決定了CD4+T細(xì)胞的分化。高表達(dá)Bcl-6的細(xì)胞最終分化為TFH細(xì)胞，而Blimp1可以促進(jìn)細(xì)胞往non-TFH細(xì)胞方向分化。Bcl-6受到多種因素的調(diào)控

4、。IL-6-STAT1， IL-12-STAT4和IL-21-STAT3通路都被報(bào)道能夠誘導(dǎo)Bcl-6的表達(dá);Batf也被認(rèn)為是能夠促進(jìn)Bcl-6表達(dá)的上游轉(zhuǎn)錄因子。同時(shí)，Bcl-6能夠受到Blimp1的負(fù)調(diào)控。
　　而本課題的研究對(duì)象TCF-1（由Tcf7基因編碼），是一個(gè)在T細(xì)胞的發(fā)育、分化、功能以及記憶過程中都具有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。在T細(xì)胞發(fā)育過程中，TCF-1在發(fā)育的不同階段具有顯著不同的功能，受到Notch信號(hào)及WNT

5、信號(hào)通路的調(diào)控。而在成熟的CD8+T細(xì)胞中，TCF-1影響活化CD8+T細(xì)胞分化命運(yùn)，同時(shí)對(duì)于記憶細(xì)胞的分化及維持均具有重要意義。在CD4+T細(xì)胞中，已經(jīng)證實(shí)TCF-1參與了TH1/TH2/TH17細(xì)胞的分化過程，是一個(gè)作用廣泛的調(diào)控分子。有報(bào)道稱TCF-1在TFH細(xì)胞中高表達(dá)而在TH1細(xì)胞中表達(dá)水平顯著下降，暗示我們TCF-1在TFH細(xì)胞中應(yīng)當(dāng)具有重要的作用。
　　我們于是和本教研室葉麗林教授課題組共同開展了TCF-1在TFH細(xì)

6、胞中的功能研究。我們利用TCF-1條件敲除小鼠、shRNA沉默系統(tǒng)、過表達(dá)系統(tǒng)以及TCF-1誘導(dǎo)敲除小鼠，在LCMV感染模型中，進(jìn)行了一系列的表型研究。我們發(fā)現(xiàn):感染后，TFH細(xì)胞高表達(dá)TCF-1、而TH1細(xì)胞中TCF-1表達(dá)水平很低，這種差異從感染后第2天持續(xù)到第8天。條件敲除或者shRNA沉默Tcf7，都能造成TFH細(xì)胞頻率、數(shù)量、功能的缺陷，并最終影響B(tài)細(xì)胞分化及抗體水平。誘導(dǎo)敲除實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TCF-1主要是在早期影響TFH細(xì)胞的分

7、化;而對(duì)于成熟TFH細(xì)胞， TCF-1影響了TFH細(xì)胞對(duì)B細(xì)胞的輔助能力。
　　雖然我們已經(jīng)證實(shí)了TCF-1對(duì)于TFH細(xì)胞分化及功能的重要性，但是TCF-1調(diào)控該過程的分子機(jī)制還并不清楚。在本研究課題中，我們通過Microarray、ChIP-PCR、CoIP等多種實(shí)驗(yàn)手段，篩選TCF-1調(diào)控調(diào)控TFH細(xì)胞分化及功能的下游靶基因，并揭示調(diào)控的詳細(xì)機(jī)制。
　　方法和結(jié)果：
　　1.篩選TCF-1調(diào)控TFH細(xì)胞分化及功能的

8、靶基因
　　我們分選了來自野生型以及Tcf7敲除小鼠感染后第8天的TFH細(xì)胞和TH1細(xì)胞。提取RNA，進(jìn)行Microarray檢測(cè)。Microarray數(shù)據(jù)顯示:相比于正常TFH細(xì)胞，TCF-1缺失的TFH細(xì)胞中有569個(gè)基因表達(dá)下降，同時(shí)有513個(gè)基因表達(dá)上升。我們將這些變化的基因，與已發(fā)表文獻(xiàn)中證實(shí)的TFH細(xì)胞分化相關(guān)基因進(jìn)行GSEA分析。發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道與促進(jìn)TFH細(xì)胞分化相關(guān)的基因，在我們的正常TFH細(xì)胞樣本組均高表達(dá)，而文獻(xiàn)

9、中與TH1細(xì)胞分化相關(guān)的基因，則在TKO來源的TFH細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。這說明，TCF-1的缺失，使得TFH細(xì)胞部分失去其應(yīng)有的細(xì)胞表型，表現(xiàn)出TH1細(xì)胞的特征。這些被TCF-1調(diào)控與TFH細(xì)胞分化功能相關(guān)的基因包括Icos，Cxcr5,Ascl2,Il21，Il6st等，其中我們發(fā)現(xiàn)，TFH細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6以及嚴(yán)重抑制TFH細(xì)胞分化的Blimp1，它們的基因表達(dá)也受到TCF-1影響。
　　2.TCF-1直接調(diào)控Bcl

10、-6-Blimp1軸
　　分別構(gòu)建了包含這兩個(gè)調(diào)控元件的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒以及突變TCF-1保守結(jié)合位點(diǎn)的突變體。在293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。結(jié)果顯示，TCF-1保守結(jié)合位點(diǎn)被突變后，Bcl6 promoter相對(duì)熒光活性降低，而Prdm1regulator則表現(xiàn)出更高的相對(duì)熒光活性，反映出TCF-1通過直接結(jié)合到這些轉(zhuǎn)錄元件的保守結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)Bcl6啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性、同時(shí)抑制Prdm1調(diào)控子區(qū)域的

11、轉(zhuǎn)錄。接下來，我們?cè)隗w內(nèi)證實(shí)了這個(gè)結(jié)論，體內(nèi)報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果與體外基本一致，在TFH細(xì)胞中，TCF-1的調(diào)控作用更加明顯。因此，我們認(rèn)為TCF-1直接結(jié)合到Bcl6啟動(dòng)子促進(jìn)其表達(dá);結(jié)合到Prdm1調(diào)控子發(fā)揮抑制作用。TCF-1直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控Bcl-6-Blimp1軸，它通過調(diào)節(jié)Bcl-6-Blimp1軸的平衡來決定CD4+T細(xì)胞分化命運(yùn)。
　　3.TCF-1與Bcl-6相互作用影響TFH細(xì)胞功能
　　我們克隆了帶有標(biāo)簽的Bc

12、l-6、TCF-1 P33、P45亞型。將Bcl-6與TCF-1的不同亞型共轉(zhuǎn)293T細(xì)胞，CoIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Bcl-6與P33、P45具有直接的相互作用。在內(nèi)源CoIP中，我們?cè)诟腥竞蟮?天活化的CD4+T細(xì)胞中，用Bcl-6的抗體進(jìn)行CoIP。在檢測(cè)到Bcl-6明顯富集的同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)TCF-1 P33、P45亞型也出現(xiàn)在Pulldown產(chǎn)物里，進(jìn)一步證實(shí)了Bcl-6-P33/P45相互作用。
　　共轉(zhuǎn)Bcl-6、P45、B-

13、catenin，結(jié)果顯示B-catenin阻斷Bcl-6與P45的結(jié)合。對(duì)于TFH細(xì)胞的分化來講，B-catenin與P45的結(jié)合具有重要意義。導(dǎo)入ICAT質(zhì)粒的SMARTA細(xì)胞，TFH細(xì)胞頻率降低，這是因?yàn)镮CAT干擾了β-catenin與P45的結(jié)合，導(dǎo)致P45不能完全發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄功能。
　　共轉(zhuǎn)Bcl-6、P33、Tle3，結(jié)果顯示Tle3能夠增強(qiáng)P33-Bcl-6相互作用。P33與Bcl-6的相互作用能夠影響B(tài)cl-6的轉(zhuǎn)錄

14、活性。我們使用了能夠被Bcl-6直接結(jié)合而不被TCF-1調(diào)控的突變Bcl6啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行報(bào)告基因檢測(cè)，當(dāng)P33與Bcl-6同時(shí)存在的情況下，導(dǎo)入該啟動(dòng)子區(qū)域的CD4+T細(xì)胞表達(dá)更高的Thy1.1。
　　最后，我們?cè)赟MARTA細(xì)胞中共轉(zhuǎn)質(zhì)粒，在沉默Tcf7的同時(shí)過表達(dá)Bcl6，沉默Tcf7造成的TFH細(xì)胞缺陷能夠完全被過表達(dá)Bcl6挽救。進(jìn)一步證實(shí)TCF-1是Bcl-6-Blimp1軸上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。
　　結(jié)論：
　

15、　結(jié)合表型研究中的發(fā)現(xiàn)以及我們?cè)跈C(jī)制研究中的重要結(jié)果。我們證實(shí)TCF-1是影響TFH細(xì)胞分化及功能的重要轉(zhuǎn)錄因子。在TFH細(xì)胞分化早期，TCF-1通過直接的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，作用于Bcl-6-Blimp1軸，促進(jìn)Bcl-6并抑制Blimp1表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞向TFH細(xì)胞方向分化;在成熟的TFH細(xì)胞中，TCF-1 P33亞型能夠與Bcl-6直接相互作用，影響B(tài)cl-6的轉(zhuǎn)錄功能，從而影響TFH細(xì)胞輔助B細(xì)胞的功能。TCF-1從多種角度發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)T