卵巢癌細(xì)胞影響外周血T淋巴細(xì)胞功能和分化的研究.pdf

1、本研究分為五部分： 第一部分卵巢癌細(xì)胞上清抑制CD8+T細(xì)胞增殖及IL-2R表達(dá)的研究 目的：研究不同卵巢癌細(xì)胞株培養(yǎng)上清液對CD8+T細(xì)胞增殖功能和表面IL-2Rα、β、γc鏈表達(dá)的影響，探討卵巢癌腹腔局部免疫抑制的形成機(jī)制。 方法：將三種卵巢癌細(xì)胞株(OVCAR3，CAOV3，SKOV3)培養(yǎng)上清液和普通培養(yǎng)液混合培養(yǎng)CD8+T細(xì)胞，MTT法測定CD8+T細(xì)胞的增殖反應(yīng)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面IL-2Rα、β

2、、γc鏈的表達(dá)，ELISA法測定培養(yǎng)上清液中sIL-2R的濃度。 結(jié)果：1.三種不同濃度卵巢癌細(xì)胞株培養(yǎng)上清液顯著抑制CD8+T細(xì)胞的增殖，并隨濃度增加而增加，和對照組比較，25％濃度時P值依次為0.004，0.006，0.013；50％濃度時P值依次為0.002，0.003，0.005；75％濃度時P值均為0.001。2.三種卵巢癌細(xì)胞上清均抑制CD8+T細(xì)胞表面IL-2R表達(dá)，其中IL-2Rβ和γc鏈表達(dá)被顯著抑制，P值依次

3、為0.002，0.013，0.011和0.015，0.039，0.040，對IL-2Rα鏈表達(dá)有抑制趨勢，但差異無顯著性，P值分別為0.235，0.224，0.498。3.三種卵巢癌細(xì)胞株培養(yǎng)上清液均使CD8+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中sIL-2R濃度顯著上升，P值分別為0.008，0.01，0.005。 結(jié)論：卵巢癌細(xì)胞株培養(yǎng)上清液對CD8+T細(xì)胞的增殖和IL-2R表達(dá)有抑制作用，可能是卵巢癌腹腔局部免疫缺陷的機(jī)制之一。 目的：

4、研究卵巢癌患者體內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性細(xì)胞的比例變化并進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)觀察卵巢癌細(xì)胞SKOV3培養(yǎng)上清對外周血淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性細(xì)胞比例的影響，為卵巢癌免疫治療提供一個可能靶點(diǎn)。 方法：收集并分離13例上皮性卵巢癌患者的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)和腫瘤相關(guān)淋巴細(xì)胞(TAL)和14例正常婦女的外周血淋巴細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面共表達(dá)CD4和CD25的比例。同時還測定卵巢癌患者外周血淋巴

5、細(xì)胞表達(dá)CD69的情況。健康婦女外周血淋巴細(xì)胞在含或不含卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清及含或不含植物血凝素(PHA)的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)72小時，再進(jìn)一步測定CD4+CD25+T細(xì)胞的比例。 結(jié)果：和健康人相比，卵巢癌患者體內(nèi)PBL，TIL及TAL中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性細(xì)胞的比例顯著增加(P=0.000，0.000，0.001)，其中腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞中這群細(xì)胞的比例比外周血和腫瘤相關(guān)淋巴細(xì)胞中要高，但差異沒有顯著性。CD69在卵巢癌患

6、者CD4+外周血淋巴細(xì)胞的表達(dá)為陰性。無論是否加入PHA，卵巢癌細(xì)胞SKOV3培養(yǎng)上清均能提高外周血中CD4+CD25+T細(xì)胞的比例(P=0.001，0.001)。 結(jié)論：卵巢癌細(xì)胞可能通過分泌某種可溶性物質(zhì)上調(diào)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例，引起卵巢癌患者體內(nèi)PBL、TIL、TAL中該亞群細(xì)胞數(shù)量增加，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制。 第三部分卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清增強(qiáng)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖及免疫抑制功能 目

7、的：明確卵巢癌細(xì)胞系SKOV3培養(yǎng)上清能否誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖及增強(qiáng)免疫抑制功能。 方法：將SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清加入培養(yǎng)基中與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞共培養(yǎng)72小時后，溴化脫氧尿嘧啶摻入標(biāo)記法測定CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖及其對靜息CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖抑制功能，流式細(xì)胞儀測定CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)GITR與CTLA-4分子的變化，半定量RT-PCR測定細(xì)胞內(nèi)Foxp3mR

8、NA的表達(dá)。 結(jié)果：SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清能顯著增強(qiáng)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖和對靜息CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖抑制功能；并誘導(dǎo)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表面GITR與CTLA-4及胞內(nèi)CTLA-4分子表達(dá)顯著增加；但對細(xì)胞內(nèi)Foxp3mRNA的表達(dá)無顯著性影響。 結(jié)論：卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清能促進(jìn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖，并可能通過上調(diào)CTLA-4和GITR分子的表達(dá)增強(qiáng)其免疫抑制功能，從而導(dǎo)致

9、卵巢癌患者局部免疫功能受抑。 第四部分卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)變CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 目的：研究卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液是否能誘導(dǎo)外周血CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。 方法：收集SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清并根據(jù)分子量大小分篩選出低(3-50kDa)，中(50-100kDa)和高(＞100kDa)分子量三個組分，將外周血CD4+CD25-T細(xì)胞分離后，對照組

10、用CD3和CD28單抗活化，實(shí)驗(yàn)組在對照基礎(chǔ)上加用不同組分卵巢癌細(xì)胞培養(yǎng)上清，72小時后分離各組的CD25+和CD25-T細(xì)胞，溴化脫氧尿嘧啶摻入標(biāo)記法測定增殖能力及對靜息的自體同源CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖抑制能力，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞GITR(glucocorticoidinducedTNFR，糖皮質(zhì)激素誘發(fā)型TNF受體)與CTLA-4分子的表達(dá)，RT-PCR檢測細(xì)胞Foxp3mRNA的表達(dá)。 結(jié)果：與對照組相反，卵巢癌細(xì)

11、胞培養(yǎng)上清作用后生成的CD4+CD25+T細(xì)胞具有免疫抑制功能，自身增殖能力下降，GITR與CTLA-4分子的表達(dá)與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞相似，并被誘導(dǎo)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3mRNA。并且僅SKOV3培養(yǎng)上清中的低分子量組分具有這種誘導(dǎo)作用，而中高分子量組分作用后產(chǎn)生的CD4+CD25+T細(xì)胞的雖增殖能力下降，但并不具備增殖抑制能力。 結(jié)論：卵巢癌細(xì)胞分泌的低分子量組分具有誘導(dǎo)外周血CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+

12、CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的能力。 第五部分卵巢癌細(xì)胞分泌的TGF-β誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 目的：研究卵巢癌細(xì)胞SKOV3分泌的TGF-β對健康婦女外周血CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響。 方法：收集SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA法測定其中TGF-β的含量，并篩選出低分子量組分(3-50kDa)。將健康婦女外周血CD4+CD25-T細(xì)胞

13、分離后，在含或不含低分子量組分或TGF-β的培養(yǎng)基中用抗CD3和CD28單抗活化CD4+CD25-T細(xì)胞，部分低分子量組分中加入抗TGF-β抗體，培養(yǎng)72小時后，進(jìn)一步磁選其中的CD4+CD25+T細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面GITR和CTLA-4的表達(dá)；溴化脫氧尿嘧啶摻入標(biāo)記法測定分選后各組CD4+CD25+T細(xì)胞的增殖能力和增殖抑制能力，RT-PCR法測定各組CD4+CD25+T細(xì)胞表達(dá)Foxp3mRNA的情況。 結(jié)果：卵巢

14、癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TGF-β濃度為2.347±0.169ng/ml，TGF-β或低分子量組分SKOV3培養(yǎng)上清作用并活化后產(chǎn)生的CD4+CD25+T細(xì)胞均對活化信號無增殖反應(yīng)，并且獲得了抑制外周血CD4+CD25-T細(xì)胞的增殖能力；這群細(xì)胞GITR、CTLA-4和Foxp3mRNA的表達(dá)情況都和天然的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性細(xì)胞相似。此外，加入抗TGF-β中和抗體后低分子量上清的這種轉(zhuǎn)化作用將消失。 結(jié)論：卵巢癌細(xì)胞分泌的TGF