轉(zhuǎn)錄因子在HuMSCs源iPSCs向男性生殖細胞誘導分化中作用研究.pdf

1、【背景與目的】精子發(fā)生是從精原干細胞發(fā)育到高度分化的精子細胞的過程，這個過程被嚴格調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄因子（TFs）發(fā)揮著重要作用。組織細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Lineage-specific transcription factors），在特異的組織細胞發(fā)育過程中通過控制細胞類型特異性基因的表達，從而影響細胞分化。精原干細胞（SSCs）是機體內(nèi)唯一能遺傳信息及表觀遺傳信息至下一代的干細胞。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在精原干細胞發(fā)育和功能維持中，Bcl6b、

2、Etv5、Lhx1、ID4、Plzf、Taf4b及Foxo1、Nanos2、Blimp1、Prdm14、Tfap2c及多種MicroRNA發(fā)揮著重要作用。
　　前期工作通過慢病毒載體將六個轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、KLF4、c-myc、Nanog及LIN28導入人臍帶間充質(zhì)干細胞（HuMSCs）中，并成功重編程為誘導多潛能干細胞（iPS），HuMSCs源iPS表達多能性相關(guān)基因（SOX2、OCT4、TDGF1、THY-1、REX

3、1和TERF1）及胚胎干細胞特異性蛋白（OCT4、TRA-l-8、NANOG及SSEA-4），在體內(nèi)外都能向3個胚層方向分化，經(jīng)BMP4誘導后能表達生殖細胞標記DDX4及早期減數(shù)分數(shù)標記 SYCP3，使晚期減數(shù)分裂標記PRM1表達量增加。Bcl6b等組織細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子在精原干細胞發(fā)育及功能維持中發(fā)揮重要作用，但其在向生殖細胞分化過程中表達變化及調(diào)控機制仍少有文獻報道。本實驗將研究組織細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Bcl6b、Etv5、Lhx1、

4、ID4、Plzf、Taf4b及Foxo1，在HuMSCs源 IPS細胞經(jīng) BMP4向男性生殖方向誘導分化過程中發(fā)揮的表達變化及其表達規(guī)律，進一步為部分不明原因的生精障礙患者的發(fā)病機制提供新理論基礎(chǔ)。
　　【材料與方法】 HuMSCs源 iPS在體外經(jīng) EB（embryoid body）形成的方法，加入誘導劑（BMP4）向男性生殖細胞方向誘導分化。EB形成后第一天（D0），向?qū)嶒灲MEB培養(yǎng)基中加入BMP4（100ng/ml），對照組

5、（自發(fā)分化組）繼續(xù)用EB培養(yǎng)基培養(yǎng)，使其自發(fā)分化。分別于不同時間點（D0、D3、D7、D10、D14及D21）觀察EB形態(tài)變化及收集細胞提取RNA通過RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子（Bcl6b、Etv5、Lhx1、ID4、Plzf、Taf4b及Foxo1）表達量變化(以誘導前即D0的表達量為基礎(chǔ)表達量，不同時間點的表達量均與基礎(chǔ)表達量相比)。
　　【結(jié)果】HuMSCs源iPS細胞經(jīng)BMP4（100ng/ml）向男性生殖細胞方向誘導分化過

6、程的不同時期，Bcl6b等七個組織細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子較自發(fā)分化組表達量升高，且表達呈程序化。Lhx1在誘導第3天表達量明顯上調(diào)，第7天表達量稍低但仍高于自發(fā)分化組，第10天又再次出現(xiàn)表達量明顯上調(diào)，且持續(xù)至第21天，差異具有統(tǒng)計學意義；在誘導第14天表達量最高，達基礎(chǔ)表達量15倍以上。ID4在誘導第3天表達量較自發(fā)分化組開始上調(diào)，且持續(xù)至第21天，差異具有統(tǒng)計學意義；在誘導第14天表達量最高，達基礎(chǔ)表達量3倍以上。Bcl6b在誘導第7天

7、表達量開始上調(diào)，持續(xù)至第14天，差異具有統(tǒng)計學意義;在誘導第14天表達量最高，達基礎(chǔ)表達量2倍以上。Etv5在誘導第7天表達量開始明顯升高，且持續(xù)至第21天，差異具有統(tǒng)計學意義；在誘導第14天表達量最高，達基礎(chǔ)表達量4倍以上。Taf4b、Foxo1及Plzf均在誘導第10天表達量明顯升高，持續(xù)至第14天，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05；Foxo1及Plzf均在誘導第14天表達量最高，分別達到基礎(chǔ)表達量的1.5倍及10倍以上，Taf4b