基于高效MultiBac-家蠶表達(dá)系統(tǒng)的人源Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)和活性研究.pdf

1、人源Ⅱ型膠原蛋白是一種大分子蛋白質(zhì)，由螺旋狀的膠原纖維、彈性蛋白和糖蛋白相互交織形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的機(jī)械強(qiáng)度。人源Ⅱ型膠原蛋白是透明軟骨的主要的組成部分，對于軟骨修復(fù)非常有效，并且預(yù)計(jì)可能成為人工軟骨材料、人工角膜材料和其他生物醫(yī)學(xué)材料。目前，膠原蛋白的生產(chǎn)主要是從動物組織中提取。動物來源的膠原蛋白的分子量和結(jié)構(gòu)易被破壞，喪失生物活性，且會產(chǎn)生異體排斥反應(yīng)和存在病毒隱患?；瘜W(xué)合成法合成的膠原蛋白缺乏必須的生物活性結(jié)構(gòu)、過程復(fù)雜且成本

2、較高。目前，應(yīng)用基因工程技術(shù)表達(dá)重組膠原蛋白已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。重組膠原蛋白不僅具有較好的生物相容性、生物可降解性和促進(jìn)細(xì)胞粘附的特點(diǎn)，還可以促進(jìn)上皮細(xì)胞形成和止血。另外，重組表達(dá)的膠原蛋白比起動物來源的膠原蛋白有較強(qiáng)的可加工性、可溶性和排斥反應(yīng)低、沒有隱藏的病毒隱患。所以，利用重組膠原蛋白作為醫(yī)藥填充物或者人工生物材料，并研究擴(kuò)大表達(dá)和優(yōu)化工藝是未來的發(fā)展方向。
　　昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種高級的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有可容納大分子

3、片段、較低的背景干擾、較強(qiáng)的翻譯后加工和修飾能力等優(yōu)勢。AcMNPV和BmNPV作為常用的基因表達(dá)系統(tǒng)的載體，已經(jīng)成功地生產(chǎn)了多種有用蛋白及蛋白復(fù)合體。
　　本研究選取人源Ⅱ型膠原蛋白（human typeⅡ collagen，簡稱ColⅡ）全序列，利用桿狀病毒多基因表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)目的蛋白。利用含特異性Tn7轉(zhuǎn)座位點(diǎn)的轉(zhuǎn)移載體pFBDM，構(gòu)建含有His純化標(biāo)簽的目的基因ColⅡ和單體櫻桃紅色熒光蛋白（m Cherry）基因的轉(zhuǎn)移

4、載體pFBDM-polh-colⅡ-p10-IM，通過Tn7轉(zhuǎn)座位點(diǎn)轉(zhuǎn)座導(dǎo)入Ac MultiBac和BmMultiBac載體，獲得E.coli rSw106-Ac-pFBDM-polh-colⅡ-p10-IM和E.coli rSw106-Bm-pFBDM-polh-colⅡ-p10-IM重組菌株。asd缺失型重組菌株rSw106-inv可表達(dá)侵染蛋白，幫助細(xì)菌直接感染昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生重組病毒。將E.coli rSw106-A c-pFBDM

5、-polh-colⅡ-p10-IM和E.coli rSw106-Bm-pFBDM-polh-colⅡ-p10-IM重組菌株分別感染Sf9、BmN細(xì)胞，3 d后可觀察到櫻桃紅色熒光，獲得重組病毒AcMNP V-ColⅡ-IM和BmNPV-ColⅡ-IM。經(jīng)SDS-PAGE和Western blot，可檢測到300 kDa的蛋白目的條帶，證明目的蛋白ColⅡ在Sf9和BmN細(xì)胞中得到表達(dá)。利用重組病毒AcMNPV-ColⅡ-IM感染Sf9細(xì)

6、胞，收集細(xì)胞和上清，應(yīng)用Ni柱親和層析純化，150 mM咪唑洗脫可獲得單一的300 kDa的蛋白目的條帶。證明細(xì)胞表達(dá)目的蛋白ColⅡ純化條件摸索清楚。利用重組病毒BmNPV-ColⅡ-IM注射5齡起家蠶幼蟲，4 d后觀察可見蠶體出現(xiàn)明顯熒光，取發(fā)熒光家蠶的血淋巴細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE、Western blo t檢測，發(fā)現(xiàn)有300 kDa的目的蛋白條帶。將蠶皮進(jìn)行處理、純化，得到的重組蛋白量可高達(dá)約1 mg/頭。純化后的蛋白經(jīng)MTT法