人Ⅲ型膠原蛋白肽在嗜熱鏈球菌中的高效表達(dá)及發(fā)酵優(yōu)化.pdf

1、膠原蛋白（collagens）是一類細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，是結(jié)締組織的主要蛋白成份，在維護(hù)各種組織的結(jié)構(gòu)完整性方面，扮演著重要的角色。膠原蛋白富含多種氨基酸，具有多種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，有著特異的組織分布，與一些器官的功能有直接的關(guān)聯(lián)，更關(guān)系到生物體的衰老。由于人源膠原蛋白的生產(chǎn)與使用存在著倫理與道德的問題。所以本論文根據(jù)人Ⅲ型膠原蛋白三肽功能區(qū)序列和合成生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)部件設(shè)計(jì)原則，通過基因工程的方法對嗜熱鏈球菌進(jìn)行改造，使其高產(chǎn)人Ⅲ型膠原蛋白肽，從而避

2、免了倫理與道德的問題。
　　本論文通過密碼子優(yōu)化的方法人工設(shè)計(jì)、優(yōu)化并合成了542bp的人Ⅲ型膠原蛋白α1鏈基因序列（col Ⅲ），包括了4個(gè)酶切位點(diǎn)、組氨酸標(biāo)簽及信號肽序列。將該基因片段連同nis I抗性片段插入線性載體pSB1C3中，構(gòu)成連接質(zhì)粒（pSB1C3-col Ⅲ-nis I）。將連接質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，得到目標(biāo)片段。將目標(biāo)片段插入載體 pMG36e中，構(gòu)成重組質(zhì)粒（pMG36e-col Ⅲ-

3、nis I）。制備嗜熱鏈球菌感受態(tài)，通過電擊的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入嗜熱鏈球菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建嗜熱鏈球菌工程菌。提取工程菌質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定、PCR產(chǎn)物測序與SDS-PAGE蛋白電泳鑒定。
　　本論文培養(yǎng)工程菌進(jìn)行Tricine SDS-PAGE電泳檢測分析，從中篩選出蛋白質(zhì)表達(dá)量最高且重組質(zhì)粒穩(wěn)定性最好的菌株。篩選最優(yōu)細(xì)胞破碎法對工程菌進(jìn)行細(xì)胞破碎處理，將破碎后冷凍離心的胞外蛋白、胞內(nèi)蛋白和包涵體蛋白進(jìn)行Tricine SDS-PAGE電

4、泳檢測、Western Blot檢測，確認(rèn)目標(biāo)膠原蛋白肽表達(dá)于胞內(nèi)與包涵體。大量表達(dá)目的膠原蛋白肽并過鎳柱純化，得到高純度的目標(biāo)膠原蛋白肽。
　　本論文制備空菌與工程菌的生長曲線，確認(rèn)工程菌的生長不因基因改造而發(fā)生變化。制備菌液 OD600下的分光光度值與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系曲線，發(fā)現(xiàn)其具有正相關(guān)性。根據(jù)經(jīng)濟(jì)原則與高效原則，優(yōu)化培養(yǎng)基碳源與氮源、培養(yǎng)溫度、紅霉素濃度、溫度、接菌量，分析得出最佳培養(yǎng)基配比與培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基中的碳源和氮源