低濃度喹諾酮對(duì)嗜熱鏈球菌生理特性及蛋白組表達(dá)的影響研究.pdf

1、近年來(lái)，低濃度抗生素殘留在許多動(dòng)物源性食品原料中存在。當(dāng)這些原料被用于生產(chǎn)發(fā)酵食品時(shí)，其中殘留的抗生素就會(huì)對(duì)作為發(fā)酵劑的乳酸菌產(chǎn)生一定的脅迫作用。同樣當(dāng)人們?cè)诜每股剡M(jìn)行治療疾病期間，人體內(nèi)的以及外源補(bǔ)充的乳酸菌也會(huì)受到抗生素的脅迫作用。在低濃度的抗生素作用下，為了阻止有害物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)，乳酸菌會(huì)產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)。此時(shí)會(huì)對(duì)乳酸菌的生理特性和發(fā)酵性能產(chǎn)生怎樣的影響，是否有不良代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，都需要進(jìn)行深入研究。本論文利用微生物生理學(xué)和

2、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段，研究了嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus，S.thermophilus)grx02在低濃度喹諾酮作用下其生理特性、發(fā)酵性能及蛋白組表達(dá)的變化，從而為全面、客觀評(píng)價(jià)乳酸菌的益生特性和安全性提供理論依據(jù)。
　　1.低濃度喹諾酮對(duì)S.thermophilus grx02生理特性的影響
　　測(cè)定了氧氟沙星(Ofloxacin, OFX)和環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CPF

3、X)對(duì)S.thermophilusgrx02的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，然后將S.thermophilusgrx02分別接種于加入0、1/2、1/10和1/50 MIC的OFX和CPFX的MRS液體培養(yǎng)基中，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線的變化，分別以光鏡和電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并測(cè)定對(duì)細(xì)胞膜通透性和胞內(nèi)乳糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響。結(jié)果顯示:S.thermophilus grx02對(duì)OFX和C

4、PFX的最小抑菌濃度分別為7.75μg/mL和3.89μg/mL，均為中度敏感。在1/2MIC的OFX和CPFX作用下，S.thermophilus grx02的生長(zhǎng)速度均顯著降低(P＜0.05)。在不同亞抑菌濃度的OFX和CPFX作用下，S.thermophilus grx02中的小菌落、微菌落數(shù)明顯增多。通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的菌體呈長(zhǎng)橢圓形，而各藥物組的菌體長(zhǎng)度隨著藥物濃度的升高而明顯變短。對(duì)照組的莢膜較厚，比較松散，而藥物組

5、的莢膜明顯的變得薄而致密，將細(xì)胞緊緊包裹住。當(dāng)OFX和CPFX的濃度達(dá)到1/10MIC時(shí)，S.thermophilus grx02的細(xì)胞膜通透性就會(huì)顯著降低(P＜0.05)。當(dāng)OFX和CPFX的濃度達(dá)到1/2 MIC時(shí)，S.thermophilus grx02胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶活力均顯著降低(P＜0.05);1/50 MIC的OFX對(duì)β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶活力的影響不大，1/50MIC的CPFX對(duì)β-半乳糖苷酶活力影響

6、也不大，但使乳酸脫氫酶活力反而增大。上述結(jié)果表明，在低濃度喹諾酮的作用下，S.thermophilus grx02啟動(dòng)了相應(yīng)的應(yīng)激機(jī)制，其生理特性也發(fā)生了一系列復(fù)雜的變化。
　　2.低濃度喹諾酮對(duì)S.thermophilus grx02發(fā)酵性能的影響
　　研究了不同亞抑菌濃度的喹諾酮對(duì)S.thermophilus grx02的凝乳時(shí)間、產(chǎn)酸能力、產(chǎn)黏能力和蛋白水解能力的影響，以及對(duì)S.thermophilus grx02發(fā)酵

7、乳的質(zhì)構(gòu)特性、流變特性、感官特性、活菌數(shù)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)原料乳中OFX和CPFX的殘留量達(dá)到1/2 MIC，會(huì)使S.thermophilus grx02發(fā)酵乳的脫水收縮性顯著增大，粘附性、膠黏性和咀嚼性顯著降低，蛋白水解能力顯著降低，同時(shí)使S.thermophilus grx02發(fā)酵乳在貯藏期間的活菌數(shù)顯著降低(P＜0.05)。當(dāng)原料乳中OFX和CPFX的濃度達(dá)到1/10 MIC時(shí)，會(huì)延長(zhǎng)S.thermophilus

8、 grx02發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間，使S.thermophilus grx02發(fā)酵乳的產(chǎn)酸速率和黏度顯著降低(P＜0.05)，使其在貯藏期間的穩(wěn)定性明顯降低;會(huì)對(duì)S.thermophilus grx02發(fā)酵乳的流變特性產(chǎn)生顯著影響，使其凝膠穩(wěn)定性降低，抗機(jī)械運(yùn)動(dòng)和溫度變化的能力降低;會(huì)對(duì)S.thermophilus grx02發(fā)酵乳的感官質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響，發(fā)酵乳出現(xiàn)了少量乳清析出，且稠厚感變差，其組織狀態(tài)得分顯著低于其他組(P＜0.05)。當(dāng)

9、OFX和CPFX殘留量達(dá)到1/50 MIC時(shí)，會(huì)使發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低，主要風(fēng)味化合物雙乙酰類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也降低，且有機(jī)酸的含量也發(fā)生了明顯的變化。綜合上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為用于發(fā)酵乳制品生產(chǎn)的原料乳中OFX和CPFX的殘留限量應(yīng)該控制在1/50 MIC以下。
　　3.低濃度氧氟沙星對(duì)S.thermophilus grx02蛋白質(zhì)組表達(dá)的影響
　　利用雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE)，比較了S.therm

10、ophilus grx02分別在空白和含有1/2MIC OFX的MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異，并利用基質(zhì)輔助光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對(duì)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定，最后對(duì)差異蛋白的功能分類(lèi)進(jìn)行了解析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:通過(guò)2-DE得到了背景清晰、分辨率較高、重復(fù)性較好的S.thermophilus grx02的蛋白組圖譜。在1/2MIC OFX作用下有47個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生顯著變化，其中

11、可以鑒定出的蛋白質(zhì)有38個(gè)，有5種蛋白質(zhì)在1/2MIC氧氟沙星作用下不表達(dá)，其中包括了冷激蛋白CspA、通用應(yīng)激蛋白Gls39、Fl-ATP合成酶、尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和硝基還原酶。有30種蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了下調(diào)，它們分別參與了糖代謝和能量代謝、蛋白質(zhì)的合成、核苷酸的合成、DNA合成、轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)等。有3種蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了上調(diào)，均為通用應(yīng)激蛋白。上述結(jié)果表明，1/2MIC的氧氟沙星會(huì)對(duì)S.thermophilus grx02的蛋白質(zhì)